酵母单杂交实验方法.docxVIP

酵母单杂分析 酵母单杂交技术是体外分析DNA与细胞内蛋口质相互作用的一种方法，通 过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结 合蛋白基因，或对结合位点进行分析。运用此技术能筛选到与DNA结合的蛋白 质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核昔酸序列而无需复杂的蛋口质 分离纯化操作，故在蛋口质研究中具有一定的优势；而且酵母属真核细胞，通过 酵母系统得到的结果比其它体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达 调控的情况。 【实验目的】 了解酵母单杂交的基本原理和应用，掌握酵母单杂交的主要步骤及注意事 项，学会酵母感受态的制作与转化，基因文库的构建及筛选。 【实验原理】 酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元 件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码LI的转录因子的基因(cDNA)o该 方法也是细胞内分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。如图所示， 将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter, Pmin)上 游，Pmin启动子下游连接报告基因。进行cDNA融合表达文库时，编码目的转 录因子的cDNA融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物(转录因子) 与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报告基因表达。根据报 告基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。 Matchmaker Gold Yeast One-Hybiid Libraiy Screening System”提供了 一个简 单高效的构建cDNA文库并进行酵母单杂交筛选的方法，它使用aureobasidin A 抗性基因作为报告基因，筛选效率高，背景低。单杂交筛选是从酵母双杂交筛选 发展而来，利用单杂交筛选可以对cDNA文库进行筛选直接获得与LI的顺式作 用元件相结合的蛋口质。 图 2 用 Matchmaker Gold One-Hybrid System 筛选 protein-DNA 相互作用的原理 The Matchmaker Gold One-Hybrid Library Screening process 主要包括以下步骤： 1将已知序列(bait)克隆到pAbAi载体。 2 pBait-AbAi质粒转化YIHGold酵母菌株，使其与酵母基因组发生重组，生成 bait/reporter 酵母菌株。 3检测YIHGold bait菌株AbAir基因的本底表达水平。 4合成cDNA并通过cDNA和pGADT7-Rec载体共转化酵母进行细胞内同源重 组筛选cDNA文库。 5筛选结果的验证和分析。 【实验准备】 1仪器设备 微量取液器(2.5 pL： 20 pL； 50 pL； 100 pL： 200 pL； 1000 pL). PCR 仪、 低温离心机、台式离心机、CHROMASPIN?+TE-400纯化柱、琼脂糖凝胶电泳 系统、凝胶成像系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金 属浴、酒精浴、无菌接种环、10 cm培养皿、15 cm培养皿等。 2实验材料 YIHGold酵母株、TOP 10大肠杆菌菌株、各种方法提取的RNA、pGADT7-Rec 质粒和pBait-AbAi质粒等。 3主要试剂 （1） Advantage 2 PCR 试剂盒、Easy Yeast Plasmid Isolation 试剂盒、Matchmaker Insert Check PCR Mix 1、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2。 （2） 各种基础培养基和营养缺陷培养基：minimal SD base, minimal SD agar base, YPD medium, YPD agar medium, -Leu DO supplement, -Ura DO supplement,腺甘酸（adenine）, PEG8000, cairing DNA, aureobasidin A, LB培养基，氨节西林。 （3） NaCl 溶液（0.9%）、sodium acetate （3moI/L）、50% PEG、10 X Li Ac （1 mol/L）、10XTE buffer. DTT （ 100 mmol/L）、RNaseH.限制性内切酶。 【实验方法】 1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建） 注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝， 且插入到pAbAi载体如力『报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含 目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于 长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核昔酸是最方便可靠的途径。 （1） 设计并合成包含□的序列的