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For personal use only in study and research; not for commercial use 细胞总蛋白的提取及裂解液 一．悬浮细胞计数 107 重悬于 0.5mlPBS（0.01M） 中，加入饱和浓度一抗 （1/10） 或 （10ug/ml） 4 C 15-30min 后，短暂离心 4000 转 X3 分，用 PBS 0.4-0.5ml 重悬（室 温），加入饱和浓度二抗（1/100 ）或（20ug/ml）,迅速置于37 C水浴中2-5分后 （迅速加入终止液 0.5ml （冷pbs中含有400uM Na3VO4 ,5mM EDTA,10mM NaF ）） , 离心4000转X3分，弃上清置于冰浴中，加入裂解液0.2-0.3ml（裂解浓度 108/ml ？ ）吸管轻轻混匀，冰点缓慢震摇孵育 30 分钟后加入 10ul 浓度为 10mg/ml 的PMSF储存液，冰点孵育 30分钟。4度离心15000g 20min。上清液即为全部细 胞溶解成分。 二．裂解缓冲液： 50mM Tris-HCl pH7.6 或 20mM Hepes pH7.4 150-300mM NaCl 1％（w/w）NP-40 （0.5%Triton-X100） 5mM EDTA （现加 1ml 加 10ul） 临用前加入蛋白酶抑制剂： Na3VO4 钒酸钠 1mM （75mM —13.3ul/ml） （用 0.2mol/L 储存液配制） PMSF 苯甲酰氟 1mM （10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml） 或 10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor （加 10-20ul） Aprotinin 抑肽酶 10ug/ml （ 10ul/ml ） （Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加 ） Western blotting 三．给你介绍一个裂解液： 50mM Tris-HCl （PH8.0）缓冲液，含： NaCl 150mM 叠氮钠 0.02% SDS 0.1% NP-40 1% PMSF 100ug/ml （使用前临时加入） （10mg/ml PMSF 用量： 10ul/ml） 尽量用少的裂解液裂解细胞，取上清电泳，最好用 6xSDS 上样 buffer。 四．我的样品蛋白是这样制备的： ?将与腺病毒转染液共培养2 4小时的细胞消化下来 .离心收集细胞 ?向离心管里加入4 0微升1 XPBS缓冲液，随后再加入4 0微升 2XLamily buffer （由 tris 碱和 SDS 组成）裂解细胞 4?将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟，放冷后离心. 5 ?测定蛋白浓度，加样电泳 我所说的前沿有蛋白是指胶的底端，不是指加样孔下面有蛋白?胶的浓度应该没 问题。 五?碧云天公司技术支持 Western 及 IP 细胞裂解液的主要成分为 20mM Tris（pH 7.5） , 150mM NaCI , 1% Triton X-100，以及焦磷酸钠，-（glycerophosphate, EDTA , Na3VO4 , leupeptin 等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。 （-20 C保存，一年有效。） 如果是贴壁细胞，按照 6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即细胞培养液量 的1/20）加入裂解液。 军科院技术支持 裂解液（50mmol/L Tris?HCl pH8.0 , 150mmol/L NaCl , 1%TritonX — 100, 100ug/ml PMSF）: 1mol/L Tris?HCl （ pH8.0） 2.5ml NaCl 0.438g Trit onX — 100 0.5ml 蒸馏水至50ml 混匀后，4C保存。使用时，加入 PMSF至终浓度为100ug/ml （0.87ml裂解液 加入 1.74mg/ml PMSF50（il）。 操作方法： 蛋白样品制备： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置 一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走） 。 2、 每瓶细胞加 3ml 4度预冷的PBS （ 0.01M pH7.2?7.3） o平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 3、 按1ml裂解液加10 ul PMSF （ 100mM ）,摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无 结晶时才可与裂解液混合。） 4、 每瓶细胞加400 ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解 30min，为使细胞充分裂 解培养瓶要经常来回摇动。 5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快