牙龈卟啉单胞菌促进4--NQO诱导的鼠食管鳞癌发生及机制.pdf

摘要 摘 要 目的在 4- 硝基喹啉-1- 氧化物 （4-nitroquinoline 1-oxide ，4 -NQO ）诱导 C57BL/6 鼠食管鳞癌模型的基础上，丝线结扎小鼠上颌第二颗磨牙和牙龈卟啉单 胞菌（Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis ）口腔涂抹建立鼠牙周炎模型，确 定 P. gingivalis 在 4-NQO 诱导鼠食管鳞癌起始阶段和癌前病变进展过程中的作 用，并探讨 P. gingivalis 在该模型鼠食管鳞癌发生和发展过程中的分子机制，鉴 定关键分子及信号通路，为食管鳞癌的防治奠定理论基础。 方法 1 C57BL/6 鼠随机分成对照组 （包括空白对照组和溶剂对照组）、P. gingivalis 感染组、4-NQO 组、4-NQO 联合P. gingivalis 组、4-NQO 联合抗生素 组、4-NQO 联合P. gingivalis 和抗生素组，每组30 只，共210 只。甲硝唑（0.2 g/L ）、新霉素 （0.2 g/L ）、氨苄青霉素 （0.2 g/L ）和万古霉素 （0. 1 g/L ）等 4 种抗生素预处理两周，50 μg/mL 的4–NQO 处理相应实验组鼠8 周后，鼠口腔上 颌第二磨牙丝线结扎、P. gingivalis 口腔涂抹感染建立鼠牙周炎模型。 2 为观测食管黏膜病变进展，22 周、26 周、30 周和 34 周时，各组鼠称 重，前3 个时间点分别处死各组鼠6 只，34 周处死 12 只。鼠食管组织沿纵轴剖 开、伸展、固定、拍照，检测鼠食管黏膜病变、食管黏膜拭子取样；3 只鼠食管 固定、石蜡包埋、切片、HE 染色，镜下观察病理变化，3 只鼠食管组织-80℃保 存，RNA 提取和转录组测序分析，34 周时，剩余小鼠按上述方法处理。 3 提取冻存食管组织 RNA 并组内制备混合样本，RNA 建库并质检、定量 后，Illumina 测序仪进行测序分析，测序原始数据过滤后比对至鼠参考基因组， 获得转录本信息，并进行基因表达定量、GO 和KEGG Pathway 分析。 4 Adobe Photoshop 图像处理软件对食管黏膜表面病变进行选取，计算病变 面积及发病率。 5 免疫组化采用中杉金桥PV-9000 试剂盒，切片脱蜡、水化、非免疫血清封 闭、3%过氧化氢溶液孵育、抗原修复，一抗 4℃孵育过夜，所用一抗包括： Ki67 （1:500, CST, 12202T ）、p-Stat3 （1:200, CST, 9145P ）、COX-2 （1:500, CST ，12282）、pH2AX （1:500, CST，80312 ），一抗过夜孵育，DAB 显色、苏 木素复染。 6 将RNA 反转录为cDNA ，qPCR 检测IL-6、cyclin D1 、IL-1β、TNF- α、 INF-γ 、c-Myc 等mRNA 分子表达变化。 I 摘要 7 统计学方法：统计学分析均采用SPSS 17.0 统计学软件分析，各组肿瘤面 积、分子表达变化比较采用t 检验或单因素方差分析，检验水准为P 0.05 。 结果 1 实验过程中对照组鼠体重无显著变化 （29.75 g ），但其它各组鼠在 22 – 34 周期间，体重逐渐降低，4-NQO 联合P. gingivalis 组降低最明显 （23.5 g ）， 其它各组鼠体重在二者之间 （27.78 g ）。 2 自22 周，4-NQO 组和4-