烟草黑胫病菌和根黑腐病菌LAMP检测方法的建立及应用.pdfVIP

摘要 摘 要 由烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)、根串珠霉(Thielaviopsis basicola)侵染 导致的黑胫病、根黑腐病是严重威胁烟叶生产的两种土传病害，在烟田常混合发 生而造成更加严重的损失。准确鉴定病原菌对病害诊断和及时制订针对性的防治 措施有重要意义。本试验以病原菌ITS 为靶标序列，建立了烟草疫霉、根串珠霉 的环介导等温扩增技术 （Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），不仅 检测结果肉眼可视、特异性与灵敏性强，而且反应条件简单。主要研究结果如 下。 以羟基萘酚蓝(Hydroxynaphtholblue，HNB)为染料，以烟草疫霉的核糖体转 ITS LAMP 4 录间隔区域 为靶标序列，应用 设计软件设计 条引物，通过优化 LAMP 反应体系，建立了烟草疫霉LAMP 快速检测体系 （Phy-LAMP）。该体系 的检测结果可直接通过反应液颜色变化判断，并用2 %琼脂糖凝胶电泳验证检测 结果。本研究对建立的体系进行特异性和灵敏度验证，并对田间采集的疑似病株 及其根际土壤进行检测。结果表明：优化的Phy-LAMP 反应体系，在特异性检 测中，只有烟草疫霉LAMP 检测反应液呈蓝色 （阳性反应），其它对照病原菌 LAMP 检测反应液颜色均呈紫色 （阴性反应）；灵敏度结果表明，LAMP 检测 灵敏度可检测到 100 fg/μL，比普通PCR 灵敏度提高了1000 倍。对5 份疑似病 株样本提取的DNA 进行检测，检测到3 份样本为阳性，且阳性病株样本常规组 织分离均分离到烟草疫霉；病株根际土壤样品DNA 检测结果与病株检测结果一 致。在室内培育的烟苗上人工接种烟草疫霉2 d，即可用LAMP 法检测到目标 菌。 以SYBR Green I 为染料，以根串珠霉的ITS 序列为目标基因序列，应用 LAMP 设计软件设计4 条引物，通过优化LAMP 反应体系，建立了根串珠霉 LAMP 快速检测体系 （Tb-LAMP）。该体系的检测结果可直接通过反应液颜色 2 % 变化判断，并用 琼脂糖凝胶电泳验证检测结果。本研究对建立的体系进行特 异性和灵敏度验证，并对田间采集的疑似病株及其根际土壤进行检测。结果表 明：优化的Tb-LAMP 反应体系，在特异性检测中，只有根串珠霉LAMP 检测反 应液呈黄绿色 （阳性反应），其它对照病原菌LAMP 检测反应液颜色均呈橙色 （阴性反应）；灵敏度结果表明，LAMP 检测灵敏度可检测到1pg/μL，比普通 PCR 灵敏度提高了10 倍。对 10 份疑似病株样本提取的DNA 进行检测，其中2 份样本为阳性，且阳性样本使用胡萝 卜圆片法分离到根串珠霉，从病株根际土壤 提取DNA 的检测结果与病株的检测结果一致。 I 摘要 本试验建立的烟草疫霉与根串珠霉LAMP 检测体系，具有较好的特异性与 灵敏性，可有效检测到烟株病组织及其根际土壤中的目标菌，为病害诊断提供了 可靠的技术手段，对病害及早采取防治措施具有积极意义。 关 键 词：烟草；黑胫病；根黑腐病；烟草疫霉；根串珠霉；LAMP 论文类型：应用基础研究 选题来源： II 目录 目 录 第1章 文献综述1 1.1 烟草主要土传真菌病害研究概况1 1.1.1 烟草黑胫病1 1.1.2 烟草根黑腐病1 1.2 植物土传病原真菌检测技术2 1.2.1 传统检测技术2 1.2.2 血清学鉴定技术4 1.2.3 分子检测技术4 1.3 环介导等温扩增技术研究进展7