引物设计与检测全过程.docx

如何在pubmed上查找一个蛋白质的基因序列 （1） 打开 WWW. 网址（百度上搜索 NCBI也可找到此网址）。 （2） 在搜索框中输入你要查找的蛋白名称或者序列号 （3） 在搜索的选择范围下拉菜单中选择 all database,然后点击搜索。 （4） 在其中nucleiotide中可以查找你需要的蛋白，的核苷酸序列。 我在NCBI上找到很多C-myc的氨基酸序列，大小不一，不知道你说的 C-myc标签的序列 的氨基酸个数和具体序列，不知道多少 KD. 其中我查到c-myc protein氨基酸有419个，其mRNA序列为1307个核苷酸。20种氨基酸 的平均分子量为 128,所以419*128=53632Dalton=54KD。如种属不对，或序列数不对，你 可以重新再NCBI上查找或者将你已知的 C-MYC蛋白质序列输入到生物分析软件中计算也 可以。 primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得 一、引物设计 step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的 mRNA在CDS选项中，找到编码 区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对 象。 2、用 Primer Premier5 搜索引物 打开 Primer Premier5，点击 File-New-DNA sequenee,出现输入序列窗口, Copy目的序列在输入框内（选择 As）,此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。 点击Primer，进入引物窗口。 此窗口可以链接到“引物搜索”、 “引物编辑”以及“搜索结果”选项， 点击 Search按钮，进入引物搜索框，选择“ PCR primers ”，“ Pairs ”，设定搜索 区域和引物长度和产物长度。在 Search Parameters里面，可以设定相应参数。 一般若无特殊需要，参数选择默认即可， 但产物长度可以适当变化，因为100? 200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300?500bp. 点击OK软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜 索结果默认按照评分（Rati ng ）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物 窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置， 引物的各种信息等。 对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3不要出现连续 的3个碱基相连的情况，比如GG（或 CCC,否则容易引起错配。此窗口中需要着 重查看的包括：Tm应该在55?70度之间，GC%应该在45%?55%间，上游引物 和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面 列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错 误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可 看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这 几个按钮都显示为“ None为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物， 所以 要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率 如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于 Oligo来完成， Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如 Primer5. 在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该 引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair ，使用PDF虚拟打印机， 即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open,定位到目的cDNA序列（在primer 中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为In ternal Stability （Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会 出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可， 而引物长度可以通过点击 Cha nge- Curre nt oligo len gth 来改变。定位后，点 击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower 按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的 引物分析功能了。 Analyze中，第一项为 Key info，点击Selected primers ，会给出两条引物 的概括性信息，其中包括引物的 Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的 Delta G 和3端的Delta G. 3端的Delta G过高