EMSA试验成功的关键因素.docxVIP

EMSA 试验成功的关键因素 :1. 试验设计 ,主要是你用药品刺激细胞时 ,设计的药品浓度和时间剃度的问 题,这个很关键 , 很多同学不注意这一点 ,最后试验确实是拿不到阳性结果 比如我一前一个朋友用药物处理 SGC7901 细胞 ,就是因为时间点设计的不 好 EMSA 试验结果是阴性的 , 后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺 激时间剃度 , 最终得到阳性结果 ! 所以这个设计很关键 !!! 给一个个人的实验总结希望能帮助大家 : 一是受体结合类的直接刺激激活 信号通路的方法，一般达到 EMSA 核转运高峰的时间比较短，大概控制在 30min-2h 之间， 很多时候都是在 45min 和 1h 达到高峰， 当然还有合适的 浓度！！！二是是你用的是药物刺激产生受体可能时间会长一些 , 因为药物还 有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程 .时间可以长一些 , 主要根据自己的 药物刺激特性确定时间点 . 核蛋白样品的制备 ; 制备蛋白样品的关键是 :1. 注意用专用的和核蛋白抽提试剂来做 ,才能使制 备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像 .2. 掌握好核蛋白的浓度和纯 度,尤其是浓度 . 能入核的蛋白本来就不是很多 , 所以核蛋白的浓度往往不 会很高 , 但是 EMSA 试验对核蛋白的浓度要求还是听高的 ! 一般要求在 1ug/ul 以上 ! 有时候稍微低于这个数量级也可以 ,但是不