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基于宏基因组学检测猪源病毒的方法建立与应用 目录 摘要IV ABSTRACTVII 缩略词表 （ABBREVIATION）10 第一章 文献综述11 1前言11 2 主要的病原检测方法12 3测序技术发展 13 3.1一代测序13 3.2 二代测序13 3.3 三代测序15 4 宏基因组学15 4.1宏基因组学的概念15 4.2 宏基因组学的研究方法16 4.3宏基因组学的应用16 4.3.1病原检测16 4.3.2 微生物群落的研究18 4.3.3生物酶的发现18 4.3.4 其他18 5猪细小病毒18 5.1猪细小病毒的病原特点18 5.2猪细小病毒的流行情况19 6研究目的与意义20 第二章 病毒宏基因组学检测方法的建立与应用21 1前言21 2 材料与方法21 2.1材料21 2.1.1 主要试剂21 2.1.2 试验毒株21 2.1.3 试验临床样品21 2.2 方法22 2.2.1去除外源核酸22 i 华中农业大学2020 届硕士研究生学位 （毕业）论文 2.2.2 核酸酶灭活23 2.2.3DNA 提取23 2.2.4DNA 多重置换扩增反应23 2.2.5 单引物扩增24 2.2.6RNA 提取24 2.2.7 单链cDNA （sscDNA）合成25 2.2.8 双链cDNA （dscDNA）合成25 2.2.9 单引物扩增26 2.2.10PCR产物的纯化26 2.2.11 产物浓缩26 2.2.12 浓缩产物质检27 2.2.13 末端修复27 2.2.14 接头连接27 2.2.15 目的片段的分离和选择28 2.2.16PCR扩增28 2.2.17PCR产物回收29 2.2.18高通量测序29 2.2.19 生物信息学分析29 2.2.20 猪繁殖障碍病例与猪腹泻病例的病毒宏基因组学分析29 3 实验结果30 3.1病毒宏基因组学平台的建立及完善30 3.1.1 浓缩样本质量检测30 3.1.2 文库构建30 3.1.3 生物信息学分析31 3.2 10例猪繁殖障碍病例病毒宏基因组学检测32 3.34 例猪腹泻病例病毒宏基因组学检测33 3.4 遗传进化分析34 3.4.1猪圆环病毒2 型遗传进化分析34 3.4.2猪细小病毒遗传进化分析35 3.4.3猪星状病毒2 型遗传进化分析37 4 讨论37 4.1 病毒宏基因组学方法优化37 4.2 猪繁殖障碍及腹泻病例的检测38 4.3 展望38 ii 基于宏基因组学检测猪源病毒的方法建立与应用 第三章 猪细小病毒2、3和6 型多重PCR 方法建立及应用..40 1前言40 2 材料与方法40 2.1材料40 2.1.1 病毒株、菌株及核酸样品40 2.1.2 临床样品40 2.1.3 主要试剂41 2.1.4 相关试剂配制41 2.2 方法41 2.2.1引物设计41 2.2.2核酸提取42 2.2.3 单重PCR扩增44 2.2.4PPVNS基因重组质粒构建44 2.2.5 多重PCR 反应条件及体系优化45 2.2.6特异性试验46 2.2.7敏感性试验46 2.2.8临床样品检测46 3结果47 3.1 单重PCR 扩增及重组质粒鉴定47 3.2 多重PCR 扩增条件的优化47 3.3 特异性试验结果47 3.4 敏感性试验结果48 3.5 临床样品检测48 3.6 PPV 感染率调查49 4 讨论50 4.1 2 3 6 PCR 50 猪细小病毒 、 和 型多重 方法的建立与优化 4.2 临床样品检测51 总结52 参考文献53 附录62 致谢70