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胆固醇25 羟化酶抑制猪δ冠状病毒增殖的机制研究 目 录 摘要 i Abstract iii 缩略语表（Abbreviation ） v 第1 章 文献综述 1 1.1 胆固醇概述 1 1.1.1 胆固醇的吸收与合成 1 1.1.2 胆固醇的代谢与分解 3 1.2 CH25H 概述 4 1.2.1 CH25H 调节胆固醇代谢 4 1.2.2 CH25H 抑制病毒增殖 4 1.3 25HC 概述 5 1.3.1 25HC 是固醇稳态调节剂 5 1.3.2 25HC 是广谱性抗病毒效应因子 6 1.4 PDCoV 研究进展 7 1.4.1 PDCoV 概述 7 1.4.2 PDCoV 的基因组结构 8 1.4.3 PDCoV 疫苗的研究进展 10 1.4.4 PDCoV 拮抗宿主免疫 11 第2 章 研究目的与意义 12 第3 章 材料与方法 13 3.1 实验材料 13 3.1.1 细胞、毒株、菌株 13 3.1.2 载体与质粒 13 3.1.3 工具酶及主要试剂 13 3.1.4 Western Blot 所需实验材料 14 3.1.5 培养基及其配制 14 3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制 15 3.1.7 主要实验仪器及设备 16 3.1.8 分子生物学分析软件 17 3.2 实验方法 17 3.2.1 PDCoV 增殖 17 3.2.2 Western Blot 17 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位论文 3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) 19 3.2.4 质粒的转化19 3.2.5 重组质粒的制备与鉴定19 3.2.6 质粒的转染20 3.2.7 病毒滴度的测定21 3.2.8 RNA 提取21 3.2.9 间接免疫荧光（IFA ）23 3.2.10 干扰分子的转染24 3.2.11 MTT 比色法24 3.2.12 统计学方法25 第4 章 结果与分析26 4.1 PDCoV 感染上调细胞内CH25H 的表达26 4.2 CH25H 抑制PDCoV 增殖28 4.3 25HC 抑制PDCoV 增殖31 4.4 25HC 抑制PDCoV 的侵入33 第5 章 讨论与结论36 5.1 讨论36 5.1.1 PDCoV 感染对CH25H 表达的影响36 5.1.2 CH25H 抑制PDCoV 增殖的机制37 5.1.3 25HC 抑制PDCoV 增殖的机制38 5.1.4 25HC 作为治疗PDCoV 感染药物开发的前景39 5.2 结论与课题展望40 5.2.1 结论40 5.2.2 课题展望40 参 考 文 献41 致 谢48 II 胆固醇25 羟化酶抑制猪δ冠状病毒增殖的机制研究 摘要 胆固醇25 羟化酶（CH25H ）是一种定位在内质网膜的羟化酶，其主要功能是催 化体内过剩的胆固醇，产生可溶性的25-羟基胆固醇（25HC ），25HC 可以通过调控 核受体和固醇调节元件结合蛋白（SREBP ）来控制胆固醇生物合成，从而减轻体内 胆固醇的积累。近年来的研究还发现，CH25H 是一种广泛的抗病毒宿主限制性因子， 通过催化合成的 25HC 阻止病毒与细胞之间的膜融合，进而抑制病毒侵入。例如， 25HC 可显著抑制人类免疫缺陷病毒（HIV ）、水泡性口炎病毒（VSV ）、人类疱疹病 毒（HSV ）等病毒的增殖。 猪δ 冠状病毒（PDCoV ）主要引起新生仔猪的呕吐、腹泻、脱水甚至死亡，是 一种新发现的猪肠道冠状病毒，对养猪业造成了较大的经济损失。研究报道25HC 处 理降低了猪肺器官中 PRRSV 滴度，同时表现出良好的保护作用。据此，研究围绕 CH25H 对 PDCoV 增殖的影