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具有不对称膜囊泡用于高效多肽药物的释放 摘要：生物药物相比化疗药物具有更低的毒副作用和广阔的发展前景。但这类药物容易被蛋白酶降解，生物利用率降低，肿瘤的穿透能力也差，使其发展受到阻碍。为了解决这个问题，我们基于实验室所特有的DTC平台技术，设计了具有不对称膜结构的囊泡mPEG-P(TMC-co-DTC)-KD10，该囊泡亲水内膜由带负电的天冬氨酸组成。通过溶液置换法制备得到载阳离子抗菌肽LTX-315的囊泡。为了增强纳米囊泡的肿瘤特异性，我们在PEG 的末端修饰了靶向配体A6，从而形成高效装载多肽药物的自交联稳定的靶向囊泡。本文研究了溶液pH、搅拌转速、理论载药量以及靶向聚合物配比等条件对药物包载的影响，针对多肽药物的载药量、囊泡粒径及其分布情况筛选出最佳条件。此外，MTT实验结果表明，A6修饰的载药囊泡比无靶向囊泡在杀死B16F10黑色素瘤细胞上表现出更优异的杀伤效果。 关键词：不对称膜囊泡;阳离子抗菌肽;LTX-315;细胞毒性 1. 前言 1.1 引言 近年来，恶性肿瘤对人类的威胁日趋严峻，对社会经济也产生巨大的影响。手术、放疗与化疗是现阶段临床上治疗癌症的主要方法。[1]化疗药物虽应用广泛，能有效抑制肿瘤细胞的生长，却无法选择性识别肿瘤细胞与正常细胞，产生较强的毒副作用。此外，在治疗过程中肿瘤细胞产生耐药性，也会大大限制了化疗药物在癌症治疗中的作用。 相比于传统的化疗药物，生物药物如蛋白质、核酸、多肽药物等因其具有更低的毒副作用等优点，受到研究者的青睐，多肽药物与其他的生物药相比，其结构简单，合成技术简便。目前研究发现，许多生物阳离子活性肽(ACPS)具有抗癌活性，它们通过静电作用与癌细胞膜相互作用或通过与细胞内靶的相互作用杀死癌细胞。在这些生物活性肽中，LTX-315((CKKWWKKW(Dip)K-NH2)一种9肽阳离子溶瘤肽表现出良好的抗癌活性和肿瘤治疗能力[2]，它可以刺激抗癌免疫应答，逆转癌细胞的耐药性。它有潜力作为一种新型的抗癌药物，而且目前正在处于临床的I期/Ⅱ期研究[3]。然而多肽药物在体内很容易被生物蛋白酶降解，生物利用率比较低，肿瘤的穿透能力也比较差。为了克服这些缺点，使多肽药物得到更好的应用，纳米药物载体的优越性能受到越来越多的关注与研究[4]。 纳米药物载体包括聚合物胶束、脂质体、纳米凝胶、聚合物囊泡等。这些纳米药物载体的粒径通常在20-200 nm，这使得它们可以利用EPR效应，有效地将抗癌药物定向输送到癌症细胞[5]。抗癌药物因此被动地富集在肿瘤组织中，并大大减小了毒副作用，降低对正常细胞的伤害。迄今为止，12种纳米药物已经在临床中投入使用，此外有1000多种纳米药物也正处于临床试验的不同阶段[6]。二十世纪后期，Adi Eisenberg和Dennis Discher教授研究并提出了聚合物囊泡的结构，引发了人们对聚合物囊泡进行了大量研究。尤其是它作为纳米药物载体的巨大潜力，正受到越来越多的关注。聚合物囊泡由两亲性聚合物在水溶液中自组装形成，较于脂质体拥有更好的稳定性和机械性能，其亲水内腔适用于包裹各种亲水性药物。此外，聚合物的多样性赋予了囊泡结构不同的性能，例如生物可降解性、刺激响应性以及体内循环稳定性等[7,8]。在囊泡表面修饰上肿瘤细胞特异性的靶向分子，可以使其在体内循环时，通过配体-受体介导进入靶向部位，于肿瘤组织中特异性聚集并释放抗癌药物，从而达到靶向治疗的目的，减小对正常器官的伤害。目前，全球范围的研究者们已经在聚合物囊泡应用于纳米药物方面取得了丰硕的成果，针对不同的需求，开发出了刺激响应性囊泡、肿瘤主动靶向囊泡、循环稳定的囊泡、生物可降解囊泡、具有不对称膜型囊泡等众多功能性囊泡，为囊泡纳米药物的临床发展奠定了基础。 1.2聚合物囊泡的组成 结合LTX-315的亲水性和带正电的性质，我们选取了聚合物囊泡作为这次毕业设计所用的纳米载体。聚合物囊泡是由两亲性的聚合物在水溶液中自组装而成的纳米粒子，它具有可以包裹疏水药物的疏水的双分子膜层，和可以包载亲水药物的内腔。调节聚合物亲疏水链段的比例可形成不同结构的自组装体，例如薄层结构、棒型胶束、球型胶束、管型囊泡和球型囊泡等。通常情况下，当聚合物亲水段占总分子量的20 % ~ 40 %时，聚合物倾向于自组装形成囊泡结构[9]。不对称膜囊泡区别于一般的囊泡结构，它的内外壳由不同的两亲性聚合物组成，较长的亲水链倾向于排列在囊泡的外壳，而较短的亲水链倾向于排列在囊泡的内壳。利用这种特殊结构，我们可以控制聚合物性质和分子量来提高囊泡的载药能力。在本论文中，基于我们课题组特有的DTC平台技术载体，我们选用了内膜由天冬氨酸修饰的聚合物载体来自组装成一种不对称膜囊泡，利用它带负电的性