医院细胞遗传室人羊水细胞培养及染色体制备作业指导书.docVIP

医院细胞遗传室人羊水细胞培养及染色体制备作业指导书 目的 规范羊水标本细胞培养及染色体制备过程，为临床羊水细胞染色体核型分析可靠性提供质量保证。 测定方法 CO2培养/手工收获。 测定原理 人的羊水细胞能长成单层并可连续进行传代培养，但它们的一些特征与一般成纤维细胞不同。在羊水中存在着各种不同类型的胎儿细胞，依据其外形和生长特征可分为以下三类：上皮细胞（E）、成纤维细胞（F）和羊水细胞（AF）。E细胞在胰酶消化的连续培养中不再生长，所以在培养过程中的生长期最短。AF细胞在培养初期就长得很好，染色体分析大多用这类细胞。F细胞在培养中的生长期最长，在较老的羊水培养物中占优势。通常在培养后3-4天（可能更早些）即出现E细胞的集落，它们不适合作染色体分析。大约在第7天出现的AF细胞可用于染色体制备。如果在培养后第10天还未见长出新的细胞，就应考虑第二次羊膜穿刺。 4 性能特征 经G显带处理后可见300-550条显带。 5 样本类型及受检者准备 在无菌条件下抽得妊娠16-22+6周羊水后，注入15ml一次性离心管中，约抽30ml，立即送检。 试剂 6.1 完全培养基100ml：在超净工作台内，用移液管将培养基和其他各试剂分装入100毫升无菌瓶中（商业化培养基或F10培养基70ml，胎牛血清30ml，双抗：青霉素和链霉素，终浓度为100U/ml，用3.5%碳酸氢钠调节pH为7.2-7.4）。 秋水仙素浓度：20μg/ml。 低渗液：0.075mol/L的KCl溶液 卡诺固定液 6.5 0.25% EDTA-trypsin 6.6 生理盐水 7 仪器及耗材 酒精灯，烧杯，天平，离心机，CO2培养箱，冰盒，载玻片，玻片盒，光学显微镜，灭菌注射器（5ml），离心管，无菌吸管，量筒，培养瓶，试剂瓶等。 8 操作程序 8.1 细胞接种与培养 8.1.1 在无菌条件下抽得妊娠16-22+6周羊水后，注入15ml一次性离心管中，约抽30ml， 立即送检。 以1500rpm离心10min。 进接种培养室，在超净工作台上吸去上清液，每管约留0.5ml，吸管打散细胞。制成细胞悬液，再加入约4.5ml完全培养基入管内，吸管充分混匀，移至25cm2方形培养瓶中，置含5%CO2的37℃温箱行开放式培养。 一般5天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，视情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上完全培养基，继续培养24-48小时，如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素0.04 -0.08µg/ml, (1ml注射器垂直加20µg/ml秋水仙素2滴)4-6小时左右后行细胞学处理。 8.2 细胞收获 倒出瓶中细胞上清液入10ml离心管中，生理盐水冲洗培养瓶细胞面两遍。 8.2.2 使用0.25% EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞，加入上清液或完全培养基终止消化。 收集细胞悬液：离心，1500rpm，10min，去上清。 8.2.4低渗：加入0.075M KCl 4-6ml，吸管吹打，37℃水浴3-5min。 预固定：加入1.5ml固定剂，轻混匀37℃水浴5min， 离心,1500rpm,10min。 固定：去上清，加入固定剂8ml左右，轻混匀，37℃水浴10min。 室温1500rpm离心10min，去上清，约留0.5ml。 8.2.8 重复固定：同第7步。 8.2.9 离心，1500rpm，10min，去上清。 8.2.10根据管底细胞量适当加入几滴新鲜固定剂。 8.2.11滴片：每片1-2滴。 8.2.12 烤片：75℃烤箱烘烤3小时。 8.2.13 第二天行显带处理，详见7.1。 9 参考范围 9.1 染色体数目：46,XN ； 9.2 染色体结构：无明显结构异常。 潜在变异来源 10.1 不排除细胞培养过程中发生突变的可能性，从而导致染色体数目或结构改变，因此应严格执行2-3线平行操作，以发现因培养过程导致的结果异常。 10.2 羊水标本应及时送检，送检过程中不宜受热或冰冻，实验人员收到羊水后应先观察羊水是否清亮，含胎脂的多少及是否为血性羊水；羊水中少量红细胞不需处理,如有明显血性羊水,立即在羊水中加入无菌肝素一滴。 10.3 接种所用器皿要进行严格的灭菌处理。 离心时，一定要注意离心机内温度，必须达到室温方可离心。 培养基pH为7.2-7.4也是羊水细胞开放式培养成功的关键，而密闭培养的pH为6.8-7.0。 10.6 注意接种时培养基不能加得过多，卧倒瓶子时，培养基不能接触瓶盖； 羊水培养首先必须有好的培养基，传统的培养基是在F10中加入一定比例的胎牛血清,由于营养成份较少,羊水细胞培养所需时间较长,培养成功率低。目前大多数实验