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P-***********Page P-*********** Page PAGE 10 of 11 微生物限度检测方法学验证方案 文件编号： P- 批准签字页 岗位 岗位 /职位 姓名 签字 日期 方案起草 微生物岗 /QC 人员 岗位 /职位 姓名 签字 日期 微生物岗 /组长 方案审核 生产部 /部长 质量部 /QA 监督员 岗位 /职位 姓名 签字 日期 方案批准 总工 质量受权人 目录 1. 目的 4 2. 范围 4 3. 责任者及职责 4 4. 验证简介 4 5． 验证过程 7 6． 结果判断 8 7． 结论和建议 8 8． 异常情况报告 8 9． 再验证 8 10 ．附件 8 附件 1：培养基的灵敏度复核 9 附件 2：稀释液的无菌性检查 10 附件 3：方法验证 11 目的 按照中国药典 2010 版（第三部） ，采用薄膜过滤法进行微生物限度检查，本方案对新修订的方法进行验证。 范围 本公司要求进行微生物限度检查的原辅料和制剂，中间制品以及消毒剂。 责任者及职责 部门 职责 起草并审核验证方案 质量部 QC 进行验证试验的具体操作 完成验证记录中相关操作记录的填写根据验证结果起草和审核验证报告 总工 负责审核并批准验证方案和验证报告 质量部 QA 审核并批准验证方案和验证报告监督验证方案的实施 验证简介 定义 CFU ：菌落数供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。 试验组 当采取薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入对应培养基中。 菌液组 测定所加的试验菌数。稀释剂对照组 用相应的稀释液替代供试品，按试验组规定的方法进行菌落计数。 样品组 样品溶液 菌悬液 稀释液 平均菌落数 （50-100CFU ） (CFU/ 皿) 供试液对照组 + - + C 供试液对照组 试验组 + + + C 试验组 菌液组 - + - C 菌液组 样品组 样品溶液 菌悬液 （50-100CFU ）  稀释液 平均菌落数 (CFU/ 皿) 稀释剂对照组 - + + C 稀释剂对照组 菌悬液 菌种及来源 培养基名称 名称及代号 编号 批号 有效期至 来源金黄色葡萄球菌 营养琼脂培养基 玫瑰红钠 琼脂培养基 Staphlococcus aureus 大肠埃希氏杆菌Escherichia coli 枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis 白色念珠菌Candida albicans 黑曲霉Aspergillus niger ATCC6538 ATCC8739 ATCC6633 ATCC10231 ATCC16404  ATCC 备注 检查人： 复核人： 检查日期： 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上， 30~35 ℃培养 18~24h ；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上， 20~25 ℃ 培养 24~48h 。上述培养物用 0.9 ％无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数 50~100CFU 的菌悬液。 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上， 23~28 ℃培养 5~7 天， 加入 3~5ml 含 0.05 ％（ ml/ml ） 聚山梨酯 80 的 0.9 ％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05 ％（ ml/ml ）聚山梨酯 80 的 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数 50~100CFU 的孢子溶液。 培养基及稀释液 培养基和稀释液的名称 培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基 稀释液： pH7.0 的氯化钠蛋白胨缓冲溶液、灭菌纯化水 培养基灵敏度复核 培养基灵敏度复核，参见《培养基的灵敏度检查操作规程》 QC252 稀释液的无菌性检查 对稀释液进行无菌检查， 14 天规定温度培养后应无菌。此操作可与其它试验同时进行。 供试液的预处理 样品名称及数量 样品 样品 取样量 / 批号 样品名称 编号 批 Sn-A Sn-B Sn -C S01 ****** 中间制品 1000ML S02 ******* 成品 200g S03 原辅料 1 200g S04 原辅料 2 200g S05 原辅料 .. 200g S06 消毒剂 20ml S07 饮用水 100ml S08 纯水制备过程水 100ml S09 . 备注 检查人： 复核人： 检查日期： 样品预处理方法 ******* 中间制品 无需处理，取原样品 50ml 作为供试液。 ****** 成品 无需处理，取原样品 50ml 作为供试液。原辅料 1 取 10g 样品，加入灭菌