dna的琼脂糖凝胶电.ppt

DNA 的琼脂糖凝胶电泳 组员：黎振威 成波 程星星 刘世杰 琼脂糖 ? 琼脂糖是线性的多聚物，基本结构是 1,3 连结的 β -D- 半乳呋喃糖和 1,4 连结的 3,6- 脱水 α -L- 半乳呋喃糖。琼脂果胶是由许多更小的分子 组成的异质混合物。琼脂糖在水中一般加热到 90 ℃ 以上溶解，温度 下降到 35-40 ℃ 时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途 的主要特征和基础。琼脂糖凝胶性能通常用凝胶强度表示。强度越高， 凝胶性能越好。 琼脂糖与琼脂的区别 ? 琼脂是由琼脂糖和琼脂果胶组成的 。琼脂糖的结构单元是 D- 半乳糖和 3.6- 脱水 -L- 半乳糖；琼脂果胶是由许多更小的 分子组成的异质混合物。它们的结构相似，但琼脂果胶带 硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。 在琼脂糖制备过程中需 要把琼脂果胶尽量去除，否则琼脂糖有可能存在极微量硫 酸根和丙酮酸取代电离基团，就会造成电内渗，电内渗对 质点的移动产生影响 。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较 低，通常在 0.2% 以下。琼脂糖是从琼脂中精细提取的， 有自身独特的性质，所以琼脂糖要比琼脂贵得多。 实验目的 ? 掌握琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的原理和方法。 琼脂糖凝胶电泳技术 特点 ： （ 1 ）操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可 以进行电泳。 （ 2 ）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占 98%~99% ），近似自由电泳，样品扩散较自由，因此电 泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 （ 3 ）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直 接用紫外光灯检测及定量测定。 （ 4 ）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量 测定。制成干膜可长期保存。 实验原理 ? DNA 分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛 效应，但 主要为分子筛效应 。在 pH=8.0~8.3 时， 核酸分子中的碱基几乎不解离，磷酸全部解离， 核酸分子带负电，向正极移动 。采用适当浓度的 凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下， 分子大小和构象不同的核酸分子的 迁移率呈现较 大的差异 ，从而达到分离核酸片段，检测其大小 的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后， 在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 影响 DNA 分子 迁移速率 的因素 ? 1.DNA 分子大小 ? 2.DNA 分子构象 ? 3. 琼脂糖的浓度 ? 4. 电压强度大小 ? 5. 离子强度大小 ? 6. 嵌入染料的存在 ( 溴化乙锭 ) 实验器材与试剂 ? 器材：板式平板电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射仪。 ? 试剂（ 1 ） 6X 上样缓冲液：含 0.25% 溴酚蓝、 ? 0.25% 二甲苯青、 30% 甘油的 TBE 缓冲液。 ? （ 2 ） 5XTBE 电泳缓冲液（ 0.45mol/L Tris- 硼酸、 0.01mol/L EDTA ， pH=8.3) ：称取 54g Tris 碱、 27.5g 硼酸、 ? 3.7g EDTA-Na 2 · 2H 2 0 ，溶于 800mL 蒸馏水中，定容至 1000mL. ? 使用时用蒸馏水稀释 10 倍成为 0.5XTBE 电泳缓冲液。 ? （ 3 ）琼脂糖。 ? （ 4 ）溴化乙锭（ EB ） 10mg/ml: 取 EB0.10g ，完全溶解于 10ml 水中， 避光室温保存。 ? （ 5 ） DNA 分子量标准品 ? （ 6 ） DNA 样品液。 实验操作 ? （ 1 ）制备琼脂糖凝胶 称取 0.6g 琼脂糖粉，放入锥形瓶中， 加入 60ml0.5XTBE 电泳缓冲液，置于微波炉或水浴中加热 熔化，取出摇匀即为 1% 琼脂糖凝胶液。待凝胶液冷却至 60 度后加入溴化锭 3ul ，使其终浓度为 0.5ug/ml 。 ? （ 2 ）胶板的制备 在制胶槽内插入样品梳，将凝胶液倒入 制胶槽中。待胶凝固后，取出梳子，将内槽放入电泳槽中， 加入 TBE 缓冲液至槽中，使其没过凝胶表面 1~2mm ，排出 加样孔中的气泡。 ? （ 3 ）加样 用移液器将 DNA 样品液 5ul 与 5X 上样缓冲液 1ul 混匀后加入加样孔，记录点样顺序。其中一个加样孔中加 入 DNA 分子量标准品 6ul 。 ? 注意：加样时需将枪头伸入加样内再排出样品，以免样品 从凝胶表面扩散；加样时，枪头不要穿刺孔底或碰坏凝胶 孔壁，否则将导致样品从凝胶底部渗出或 DNA 带型不整齐。 ? （ 4 ）电泳 接通电泳槽与电泳仪之间的电源（切 忌 DNA 样品由负极往正极泳动）。调节电压 [U=5V/cmX 正、负极间的距离（ cm ） ] ，开始电 泳。 ? （ 5 ）实验结果的观察 在紫外透射仪上观察电泳 带及其位置， 用 300nm( 波长太长灵敏度不够，太 短对 DNA 损伤严重 ) 左右波长的紫外线照射，