ZbFAD2与ZbFAD3基因在花椒麻味素合成途径中的功能初步研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim ）为芸香科花椒属植物，具有很高的食用及 药用价值。麻味素是花椒中产生风味和药用活性的特有成分，现已分离出27 种，均为 不饱和脂肪酸酰胺类物质。目前对这类化合物在花椒中合成调控和次生代谢途径的研 究较少，仅有文献报道麻味素可能由氨基酸脱羧后的产物和不饱和脂肪酸两部分结合 组成，但具体的合成通路至今尚未阐释清楚。课题组前期对麻味素积累差异大的三个 花椒品种进行了转录组测序，筛选出19 个与不饱和脂肪酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨 酸生物合成相关的差异基因。本研究在此基础上针对不饱和脂肪酸合成过程中的两个 关键基因（c99494 graph_c0 和c102796 graph_c0 ）进行了功能的初步验证，旨在为麻 味素合成通路的进一步阐明提供理论依据。主要结果如下： 1．对转录组获得的目的基因c99494 graph_c0 和c102796 graph_c0 全长cDNA 序 列进行生物信息学分析，同源序列比对表明，其属于不饱和脂肪酸脱氢酶并预测两个 目的基因分别为ZbFAD2 和ZbFAD3 。通过ORF Finder 分析确定两个目的基因的读码框 长度分别为1152bp 和1167bp。对ZbFAD2 和ZbFAD3 序列所编码的氨基酸序列和其他 10 种植物的氨基酸序列构建进化树，结果表明花椒与柑橘属最先归为一类，亲缘关系 较近，而与栎属以及黄麻属的亲缘关系较远。通过氨基酸序列分析预测了蛋白性质与 结构，其中ZbFAD2 预测蛋白质共有383 个氨基酸，分子量为44.16kDa，等电点为8.04， 亲水总平均值（GRAVY ）为-0.013，不稳定指数为37.48 ；ZbFAD3 预测蛋白质共有388 个氨基酸，分子量为44.79kDa ，等电点为8.76，亲水性总平均值为-0.116, 不稳定指数 为33.76 。 2 ．成功构建了T7-pET30a-ZbFAD2 和T7-pET30a-ZbFAD3 原核表达载体，并用其 转化E. coli BL21 表达菌株。IPTG 诱导目的基因ZbFAD2 与ZbFAD3 表达，并纯化得 到两个重组蛋白。通过SDS检测发现得到的两个蛋白大小均在44kDa 左右，此 结果与预测大小相符。利用气相色谱检测技术，对蛋白酶进行底物反应及产物鉴定， 9 9,12 发现重组蛋白ZbFAD2 可以和底物油酸（C18:1△ ）反应生成了亚油酸（C18:2△ ）， ZbFAD3 可以和底物亚油酸反应生成α-亚麻酸（C18:3△9,12,15 ），此结果证明目的基因 与其同源序列的功能相同即分别在脂肪酸链中引入第二个双键和在脂肪酸链中引入第 三个双键的过程中起到催化作用。 3 ．成功构建了35S-pCAMBIA2300-ZbFAD2 与35S-pCAMBIA2300-ZbFAD3 植物过 表达载体，并通过农杆菌介导法分别将其转化至烟草和拟南芥。通过气相色谱测定转 基因拟南芥中脂肪酸的含量，发现ZbFAD2 转基因型拟南芥种子与野生型相比油酸含 I 西北农林科技大学硕士学位论文 量降低，亚油酸含量升高，而在ZbFAD3 转基因型拟南芥中亚油酸含量降低，亚麻酸 含量升高，再次验证了ZbFAD2 可以催化油酸反应生成亚油酸，ZbFAD3 可以催化亚油 酸反应生成α-亚麻酸。利用高效液相色谱法测定转基因烟草中麻味素的含量，ZbFAD2 转基因型烟草叶片中羟基-α- 山椒素含量（0.2167 ±0.0026 mg/g ）明显高于野生型（0.0875 ±0.0049mg/g ），而在ZbFAD3 转基因型烟草叶片中羟基-α- 山椒素含量（0.0535 ±0.0037 mg/g ）则明显低于野生型，验证了这两个目的基因在麻味素合成通路中具有一定的作 用，且不饱和脂肪酸合成与麻味素的合成相关。 关键词：花椒；麻味素；差异基因；不饱和脂肪酸脱氢酶；功能验证 II