陆地棉扩展蛋白基因家族特征分析与功能验证.pdfVIP

摘 要 摘 要 棉花作为重要的经济作物，为纺织业提供了重要的原材料。目前，人们的生活质 量和纺织水平日渐提高，故而对棉纤维品质的要求日益严苛。棉纤维作为研究细胞伸 长及细胞壁结构的重要模型，是由胚珠外表皮细胞发育而来的单细胞表皮毛，具有高 度伸长、无分支且增厚的特点。扩展蛋白是一种细胞壁相关蛋白，对纤维细胞的起始、 伸长具有积极的促进作用；除此之外，细胞壁的特性对成熟棉纤维品质的好坏起关键 作用。本研究主要通过生物信息学鉴定陆地棉Expansin 基因家族并分析其进化特征， 利用转录组测序（RNA-seq ）数据研究其表达的时空特征，并利用qRT-PCR 对表达谱 进行验证。基于表达谱数据，选择四个基因进行克隆和功能验证：在拟南芥中进行 Expansin 基因的过表达，在棉花中进行 VIGS （基因沉默），最后通过农杆菌菌液浸种 将过表达载体转移到棉花中。主要结果如下： 1、根据拟南芥和水稻扩展蛋白的氨基酸序列 （作为query ），进行BLAST 比对，在陆 地棉中共鉴定出98 个扩展蛋白基因家族成员，其中71 个属于EXPA 亚家族，8 个 属于EXPB 亚家族，6 个属于EXLA 亚家族，13 个属于EXLB 亚家族。陆地棉的 大部分染色体上均有 3-5 个 Expansin 基因，且部分基因出现串联重复（tandem duplication ）的现象。 2 、同线性分析显示，大多数Expansin 基因位于同线性染色体区段内，表明扩展蛋白家 族的扩张（多达 98 个）主要是由于进化过程中染色体片段重复（segmental duplications ）造成的，因而亚基因组内Expansin 基因之间存在一定的平行同源关系 （paralogous ）；AA 与DD 两个物种的杂交加倍进化形成AtAtDtDt 的陆地棉后，促 进了Expansin 基因成员数的加倍（尽管少数基因发生了丢失）。系统发育树中，末 端分支由二倍体棉与四倍体陆地棉的4 个基因构成，表明四倍体陆地棉的两个亚基 因组（At 与Dt ）与二倍体棉基因组（A 与D ）的Expansin 成员的氨基酸序列的进 化关系较近；同线性分析、基因结构分析和模体结构分析进一步确认了其进化关系。 3、陆地棉98 个扩展蛋白的基酸序列长度平均为248 个aa，分子量平均为27.00 kD ， 等电点平均为 8.48 （大部分属于偏碱性蛋白）。Expansin 蛋白不稳定指数在 20.03-46.80 之间，大部分蛋白稳定性好；脂溶指数平均为 70.83 ，总平均疏水性 （GRAVY ）在-0.392-0.140 之间，属于两性蛋白。72 个扩展蛋白中有长度不等的信 号肽，均定位于细胞外，Expansin 基因具有一定的密码子偏好性。 4、RNA-seq 数据显示，Expansin 基因具有各自特异的时空表达模式。具有部分同源关 系的基因对（homeologous gene-pair ），其表达模式也不尽相同，表明多倍化后的进 化过程中家族成员间基因功能的异化（多样化）与互补。通过实时荧光定量 PCR I 西北农林科技大学硕士学位论文 对RNA-seq 数据进行了验证，结果表明两种方法的表达谱数据，吻合度较高；各扩 展蛋白基因在不同的时空条件下表达丰度各异，各司其职。 5、基于 RNA-seq 和 qRT-PCR 的表达谱数据，选择 GhEXLA3A 、GhEXPA03A 、 GhEXPA24D 和GhEXPA27D 四个基因进行克隆，通过“花絮浸染法”转化拟南芥。结 果表明，过表达基因GhEXPA27D 会促进拟南芥的根系发育，提前抽薹，分支数增 多，果荚数及种子产量也有所增加。利用VIGS 基因沉默技术对棉花植株进行基因 GhEXLA3A 表达的干扰，结果显示，两周后的幼苗根系及植株较小（和对照相比）； 对被VIGS 处理的植株进行qRT-PCR ，发现GhEXLA3A 基因的表达量变化不大。通 过农杆菌菌液浸种，将基因GhEXP