精源性miR-301a靶向ACVR1对牛早期胚胎发育的影响.pdfVIP

摘要 摘要 精子是一类遗传物质高度浓缩的细胞，与卵母细胞结合后可以形成一个完整的个 体。除了遗传物质，精子还可以携带蛋白、编码RNA、非编码RNA 如miRNAs等进 入卵母细胞，影响早期胚胎发育。实验室前期通过精子与卵母细胞的miRNA 高通量 测序筛选出牛精源性miR-301a，体外获得性实验证实其参与孤雌激活(Parthenogenetic Activation,PA)胚胎第一次卵裂及囊胚形成调控。同时，鉴定出ACVR1是miR-301a 的靶基因。本研究旨在对miR-301a通过靶向ACVR1参与牛早期胚胎发育调控及其分 子机制做一初探。 本研究进行了以下试验：(1)确定miR-301a 与ACVR1在胚胎中的靶向调控关系； (2)探究敲降ACVR1对牛早期胚胎发育的影响；(3)初步探究miR-301a 靶向ACVR1 调控早期胚胎发育的机制。结果如下： 1. 体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT)胚胎显微注射miR-301a mimic 或体外受精(In Vitro Fertilization,IVF)胚胎显微注射miR-301a inhibitor 后检测 ACVR1mRNA 及蛋白表达情况，发现无论是mRNA 还是蛋白水平，miR-301a均能下 调ACVR1的表达，验证了miR-301a 与ACVR1的靶向调控关系。 2. PA胚胎显微注射siRNA敲降ACVR1后检测胚胎发育情况。结果表明，ACVR1 PA PA 敲降以后延长了 胚胎第一次卵裂时间，但是不影响总卵裂率，同时显著提高了 胚胎囊胚率和囊胚质量。此结果和PA 胚胎注射miR-301a mimic 表型相同，表明 miR-301a通过靶向ACVR1调控牛早期胚胎第一次卵裂及囊胚发育。 3. 检测了胚胎中TGF-β通路配体BMP4及除ACVR1外受体表达，并推测BMPR2 是最有可能与ACVR1互作的Ⅱ型受体。 4. PA 胚胎敲降ACVR1后，TGF-β通路下游信号转导Smad1/5及Smad2 蛋白磷 ID1 ID2mRNA SCNT miR-301a 酸化水平降低，并且下调了靶基因 、 表达。 胚胎注射 mimic 后同样可以引起Smad1/5及Smad2 蛋白磷酸化水平的降低，然而，IVF 胚胎注 射miR-301a inhibitor 后引起这两个蛋白磷酸化水平的升高。说明miR-301a 靶向 ACVR1参与TGF-β信号通路的激活。 5. SCNT 胚胎注射miR-301amimic 后2-细胞时期核H3K27me3 荧光强度升高， IVF 胚胎注射miR-301a inhibitor 后无明显变化，说明miR-301a 可以影响组蛋白 H3K27me3修饰。 6. PA 胚胎中敲降ACVR1后F-actin 的荧光强度降低，而IVF 胚胎缺失miR-301a 后F-actin 的荧光强度增强，表明miR-301a 可通过ACVR1影响微丝骨架动态变化。 I 西北农林科技大学硕士学位论文 进一步研究发现，IVF 胚胎中F-actin 变化是由p-Cofilin1蛋白介导的。 综上所述，精源性miR-301a靶向ACVR1调控TGF-β信号通路的激活，并影响微 丝骨架动态变化和组蛋白H3K27me3修饰，最终延长胚胎第一次卵裂时间并提高囊胚 率。 关键词：精源性miR-301a；ACVR1；TGF-β；早期胚胎发育；牛 II 目录 目录