猪GM-CSF双抗体夹心ELISA的建立及其初步应用.pdfVIP

摘要 摘要 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome ，PRRS ）是一 种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）感染引起的免疫抑制性疾病，其主要引起仔 猪死亡、肥育猪生长缓慢、母猪中晚期流产和死胎。PRRSV 感染具有严格的细胞嗜性 和受体依赖性，其在体内主要感染以肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages ，PAMs ） 为代表的单核- 巨噬细胞谱系（monocyte-macrophage lineage ）。PRRSV 感染使体内多种 细胞因子表达失调，不同毒力PRRSV 毒株的感染导致PAMs 在细胞因子的表达上也有 一定差异。粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF) ，最初发现该细胞因子在造血细胞的发育分化过程中发挥重要功能。最 新研究表明，在受到不同信号刺激和免疫微环境的影响下，GM-CSF 在疾病发展和炎 症反应中表现为双向调控：一方面能够募集炎性巨噬细胞进入感染或炎症局部组织， 进一步加剧炎症反应；另一方面也可以通过招募免疫调节性树突状细胞而对免疫应答 负调节。虽然有报道利用猪GM-CSF 与PRRSV 疫苗株或PRRSV 结构蛋白融合表达用 于增强疫苗的免疫保护效果，但对于该细胞因子在PRRSV 感染过程中的作用尚无报道。 因此本课题首先建立一种猪粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF ）的双抗体夹心 ELISA 定量检测方法；进一步通过该方法对不同 PRRSV 毒株感染 PAMs 后细胞分泌 pGM-CSF 蛋白与PRRSV 攻毒组和抗体治疗组的动物血清中pGM-CSF 蛋白的含量进 行分别测定，初步确立该检测方法的应用范围。本研究的工作和结果如下： 1.抗pGM-CSF 单克隆抗体与多克隆抗体的制备与活性鉴定 构建原核重组表达载体pET28a-pGM-CSF，表达并纯化了重组pGM-CSF 蛋白，重 5 组蛋白免疫BALB/c 小鼠与新西兰大白兔。待小鼠血清中抗体效价达到10 及以上后， 进行细胞融合。阳性克隆经过三轮亚克隆后获得稳定分泌抗pGM-CSF 的单克隆抗体两 株，分别命名为Mab-1B7E10 与Mab-2A4H11 ，经验证具有良好活性。待兔血清效价达 6 到10 及以上时，采集阳性血清。CNBr 活化的琼脂糖4B 耦联重组pGM-CSF 蛋白用于 兔多抗的纯化，亲和层析后获得纯度较高的抗pGM-CSF 的多克隆抗体，经验证具有良 好活性。 2.抗pGM-CSF 双抗体夹心ELISA 检测方法的建立 以Mab-2A4H11 作为捕获抗体（包被浓度为10 μg/mL），兔多克隆抗体作为检测抗 体（浓度为 1.6 μg/mL），建立定量检测pGM-CSF 的双抗体夹心ELISA 检测方法，条 件为捕获抗体4℃包被过夜，5%脱脂奶粉37℃封闭 1 h ，待检样品、检测抗体与酶标 二抗依次分别37℃孵育1 h 后显色。以梯度稀释的重组pGM-CSF 蛋白作为标准品绘制 I 西北农林科技大学硕士学位论文 标准曲线，确定检测方法的灵敏度为42.5pg/mL ，通过无关细胞因子的检测，确定检测 方法的特异性。 3.建立的双抗体夹心ELISA 检测方法的应用 应用本课题建立的双抗体夹心ELISA 检测方法对不同PRRSV 毒株感染PAMs 后 细胞分泌pGM-CSF 蛋白与PRRSV 攻毒组和 PRRSV 攻毒+抗体治疗组的动物血清中 pGM-CSF 蛋白的含量进行分别测定。不同毒株PRRSV 感染PAMs 后，在mRNA 水平 上，与对照组相比，均有显著性升高，随后分别使用上述建立的ELISA 检测方法和商 品化试剂盒对感染PRRSV 的PAMs 细胞培养上清中pGM-CSF 蛋白进行检测，结果显 示两种方法均未检测到分泌的pGM-CSF 蛋白，提示PRRSV 感染细胞的过程中存在转 录后抑