粘虫三磷酸肌醇受体及质膜钙泵在雷公藤次碱杀虫作用中的功能研究.pdfVIP

摘要 摘要 雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）是卫矛科雷公藤属木质藤本植物，具有资 源丰富、杀虫活性高、广谱、对哺乳动物安全等优点。雷公藤次碱是其主要杀虫活性 成分，具备开发为高效安全新型生物农药的潜力。然而，雷公藤次碱的杀虫分子靶标 及作用机制至今尚不清楚。根据前期研究结果，推测雷公藤次碱作用于粘虫的肌肉系 统，对钙离子通道及钙信号通路相关基因的表达有显著影响。基于以上，本研究以粘 虫为研究对象，分别克隆了粘虫1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP R ）和质膜钙泵（PMCA ） 3 基因，并分析了两种基因在粘虫中的时空表达，同时利用 RNAi 技术验证了两种钙通 道蛋白在雷公藤次碱杀虫作用中的功能，为进一步阐明雷公藤次碱的杀虫作用机制奠 定基础。主要研究结果如下： 1、利用反转录多聚酶链式反应技术（RT-PCR ）分别克隆了粘虫IP R 和PMCA 基 3 因序列，分别命名为MsIP R 和MsPMCA 。MsIP R 开放阅读框长8118 bp ，编码2076 3 3 个氨基酸，预测其蛋白分子量和等电点分别为304784.46 和6.04，编码蛋白具6 个疏水 跨膜区域。MsPMCA 开放阅读框长3438 bp ，编码1146 个氨基酸，预测其蛋白分子量 和等电点分别为125957.46 和6.59，编码蛋白具10 个疏水跨膜区域。 2 、通过荧光定量PCR 技术检测了IP R 和PMCA 基因在粘虫不同发育阶段及组织 3 中的表达情况。MsIP R 与MsPMCA 在粘虫各个生长发育阶段及5 龄幼虫的各组织中均 3 有表达，其中，MsIP R 在粘虫成虫阶段相对表达量最高，是蛹期的21.28 倍，在不同 3 组织中，体壁肌肉中相对表达量分别是头部和消化道的6.19 和4.23 倍；MsPMCA 的表 达分布与MsIP R 类似，MsPMCA 成虫阶段相对表达量是卵期的17.62 倍，而体壁肌肉 3 分别为头部和消化道的1.71 和1.54 倍。 3、粘虫IP R 可能不是雷公藤次碱的杀虫靶标。利用RNAi 技术验证了粘虫IP R 3 3 在雷公藤次碱杀虫作用中的功能。注射IP R 基因 dsRNA （dsIP R 1 和 dsIP R2 ）片段 3 3 3 72 h 后对IP R 的干扰率分别为39%和51% ；注射dsIP R 后对试虫幼虫的体重变化无 3 3 明显影响；注射dsIP R 48 h 后，再以LC 剂量的雷公藤次碱饲喂48 h 后，试虫死亡 3 50 率分别为52.41%和57.58%，与同剂量下雷公藤次碱单独处理的试虫组无显著差异，说 明dsIP R 干扰后的试虫对雷公藤次碱的敏感性无显著变化，IP R 可能不是雷公藤次碱 3 3 的作用靶标。 4 、PMCA 可能为雷公藤次碱的作用靶标之一。注射PMCA 基因dsRNA （dsPMCA1 和dsPMCA2 ）片段48 h 后的干扰率分别为43%和49% ； dsPMCA 注射后试虫体重增 长无明显变化，但注射dsPMCA 48 h 后，饲喂带毒叶片 （LC50