自然光周期下NR1D2对陕北白绒山羊毛囊周期再生调控研究.pdfVIP

摘要 摘要 绒山羊属于季节性毛被脱换的动物，毛被为粗毛和绒毛组成，分别由初级毛囊和 次级毛囊产生，绒毛呈现典型的周期性生长规律，这使得它们成为研究毛发再生循环 机制的模型。在自然光周期下，绒山羊毛囊经历生长期，退行期和休止期的周期变化。 光周期是控制羊绒季节性变化的主要因素之一，而光周期对绒毛生长的节律变化影响 的相关基因可能在毛囊生长中起关键作用。由于生物节律性变化往往受生物钟基因的 调控，而这些生物钟基因是否会对绒山羊毛囊的周期变化起作用仍待研究。因此，本 研究以陕北白绒山羊为材料，通过筛选自然光周期下陕北白绒山羊绒毛周期生长的可 能的生物钟基因，并研究其可能的作用途径，来揭示绒山羊绒毛生长的周期性变化机 制。主要内容包括：（1）通过HE 染色和免疫组化观察陕北白绒山羊不同时期毛囊变 化，探讨在毛囊周期循环中生物钟基因的表达变化，并结合组织表达筛选重要的生物 钟基因；（2 ）根据筛选到的Nr1d2 基因，探究可能对NR1D2 表达有影响的miRNA ， 通过双荧光素酶报告系统筛选miRNA ，并验证其与Nr1d2 基因的靶向关系。（3 ）在 毛乳头细胞中超表达或干扰chi-miR-218 ，进一步验证miRNA 对于Nr1d2 基因的调控 作用。 主要研究结果如下： 1. 绒毛的生长状况与环境因子进行相关性分析，结果发现绒毛的生长与光照、温 度、相对湿度等环境因素有一定的相关性，而其中光照这一环境因素与绒毛的生长的 相关性最高。通过对陕北白绒山羊生长期、退行期和休止期皮肤样品中生物钟基因的 表达检测，发现生物钟基因的表达量没有显著差异。结合免疫组化试验中生物钟基因 在皮肤中的定位，发现生长期NR1D2 在外根鞘和毛球部位都有表达，最终我们筛选 出Nr1d2 基因作为重点研究对象并检测了其蛋白的表达量，结果发现皮肤组织在生长 期的NR1D2 蛋白表达最高。 2. 通过数据库 miRbase ，我们筛选了两个靶向 Nr1d2 基因的 miRNA ，分别为 chi-miR-128-3p 和 chi-miR-218 。通过双荧光素酶报告检测系统确定 chi-miR-218 与 Nr1d2 基因具有靶向关系，超表达的chi-miR-218 会显著抑制Nr1d2 基因的表达，并 且干扰NR1D2 蛋白表达；检测了chi-miR-218 在不同时期皮肤样品中的表达情况，结 果发现不同时期chi-miR-218 的表达量具有差异性，在休止期高表达；之后我们检测 了chi-miR-218 对于细胞凋亡的影响，结果显示chi-miR-218 可以促进细胞的凋亡。 通过以上的研究，我们发现光照与绒毛的生长有着密切的关系。在自然光周期的 条件下，生物钟基因在陕北白绒山羊皮肤毛囊组织上的定位及在不同时期蛋白表达变 I 西北农林科技大学硕士学位论文 化，筛选到重要的生物钟基因Nr1d2 ，并且确定了chi-miR-218 靶向Nr1d2 基因，在 毛囊细胞中过表达 chi-miR-218 ，检测对Nr1d2 基因的表达影响，这些为进一步揭示 绒山羊毛囊周期变化的调控机理奠定基础。 关键词：陕北白绒山羊；生物钟基因；NR1D2 ；chi-miR-218 II 目录 目 录 摘要I ABSTRACT III 第一章 文献综述 1 1.1 绒山羊毛囊结构 1 1.2 毛囊周期循环 2 1.3 羊绒生长规律 4 1.4 生物钟的简介 5 1.4.1 生物节律 5 1.4.2 生物钟分子机制 5 1.4.3 环境因素对生物钟基因的作用 7 1.5 研究目的与意义 8 第二章 生物钟