细胞工程综合实训报告.docx

2010—2011 学年第二实践学期 细胞工程综合实训报告 专 业： 班 级： 姓 名： 学 号： 2011 年 9 月 1 日 实验日期： 2011.7.4-2011.7.12 实验地点：农学院生物技术实验室及农学院创新实验室 蓝莓细胞悬浮培养 一、实验目的 （1）掌握蓝莓细胞悬浮系建立的方法和原理 （2）学会对悬浮细胞培养物进行细胞计数及绘制细胞生长曲线 二、实验材料 蓝莓愈伤组织 三、实验试剂 MS液体培养基、三氧化铬、0.1%酚藏红花、0.1%荧光素双醋酸酯（FDA 四、实验仪器 超净工作台、 高压灭菌锅、 旋转式摇床、 水浴锅、 倒置显微镜、 镊子、 酒精灯、100ml三角瓶、移液管、PH计、漏斗、不锈钢网、血细胞计 数板 五、实验步骤 1、 配制MS液体培养基500ml （平均分装在11个三角瓶中），高压灭 菌，常温放置 1-2 天，观察无菌后备用。 2、 超净台内，镊子夹取生长旺盛的蓝莓愈伤组织，夹碎放入含 MS的 培养瓶中，每瓶 1-1.5g. 扎紧瓶口。 3、 将接种完毕的三角瓶置于旋转式摇床上。 100r/min,25-28 C条件 下进行振荡培养。 4、 培养 6-10 天后，进行第一次继代培养。 5、悬浮培养物的过滤：继代培养几天后，若仍含有较大的细胞团， 则用适当孔径不锈钢网过滤，再将滤后的悬浮细胞继续培养。 6、细胞数目计算：取一定体积的细胞悬液，加入 2 倍体积的 8%三氧 化铬，置于70 C水浴处理15分钟。冷却后，用移液管重复吹打细胞 悬液，以使细胞充分分散。 混匀后，取一滴悬液置于细胞计数板上计 数。 六、注意事项 1、 各步骤均需无菌操作！培养基、用具、器皿等要高压灭菌后方可 使用。 2、 如培养液浑浊或呈现乳白色，表明已污染。 3、 每次继代培养时，应在倒置显微镜下观察培养物中各类细胞及其 残余物的情况，有意识的留下圆细胞，弃去长细胞。 七、实验记录 2 O 7 g 7 4 蓝莓愈伤组织悬浮培养 松江鲈鱼细胞体外培养 一、实验材料 松江鲈，捕于鸭绿江。 透明质酸酶、II型胶原酶、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生 长因子、胰蛋白酶、L-15、MEM DMEM/F-12培养基、胎牛血清、含 羧甲基壳多糖（50ug/ml）、N-乙酰葡萄糖盐酸盐（50ug/ml）、碱性成 纤维细胞生长因子（bEGF 10ng/ ml）、表皮生长因子（EGF, 10 ng/ mL)。青霉素(1000 IU /ml)、链霉素(1000卩 g/ml)。 磷酸缓冲液PBS 6.70g Na2HPO4? 2H2O,3.25g KH2PO4，溶于蒸馏水 并定容至 100mL。 二、实验方法 1 、松江鲈鱼鳍、心脏和鳔组织的原代培养 活松江鲈暂养在含有高双抗(1000 IU / mL青霉素，1000卩g /mL 链霉素)的消毒淡水中 24h。 ( 2)将鱼在 75%酒精中浸泡 1-2min ，无菌取出鳍、心脏和鳔组织， 经磷酸缓冲液分别漂洗 2 次。 将组织置于5%FBS-DMEM/F培养基中剪成约1 mm3碎块。 ( 4)鳍的组织碎块用 0.5%透明质酸酶和 0.2%II 型胶原酶联合消化 1h。 (5)心脏组织碎块用 0.125%胰酶消化 10min。 ( 6)鳔的组织碎块不进行任何消化。 3种组织碎块分别离心收集沉淀，用 5%FBS-DMEM/F培养基充 分悬浮并均匀接种于25cm2培养瓶中。 置24C干贴处理6h,加入含20%FBS勺培养液至5mL,于24C 进行原代培养。 2、松江鲈鱼鳍、心脏、鳔细胞体外勺最适培养基、培养温度和最适 PH的确定 向干贴6h的鳍、心脏、鳔组织块中分别加入 PH=7.0、含羧甲基壳多 糖(50ug/ml) ,N-乙酰葡萄糖盐酸盐(50ug/ml),碱性成纤维细胞生 长因子( bEGF，10ng/ mL), 表皮生长因子 ( EGF , 10 ng/ mL) ，含 20呱台牛血清的L-15、MEM DMEM/F-12培养液至5ml/瓶中，置24 °C 进行原代培养 ,分别观察组织块在 3 种不同培养基中细胞的迁出、贴 壁及增殖情况 ,确定最适培养基。 将培养在最适培养基中的三种组织细胞，加入 PH=7.0含羧甲基壳 多糖( 50ug/ml ),N- 乙酰葡萄糖盐酸盐( 50ug/ml )，碱性成纤维细胞 生长因子(bEGF 10ng/ mL),表皮生长因子(EGF , 10 ng/ mL), 分别置于20 C、24 C、28 C进行原代培养，观察不同温度下细胞的 迁出、贴壁及增殖情况，确定最适培养温度。 将培养在最适培养基和最适温度的三种组织细胞，加入 PH=7.0、含 羧甲基壳多糖(50ug/ml) ,N-乙酰葡萄糖盐酸盐(50ug/ml),碱性成 纤维细胞生长因子( bEGF， 1