细胞培养兼转染步骤.docx

细胞复苏 准备好超净台、吸管、离心管、40C的水 从液氮中取出要复苏的细胞，置于准备好的 37°C中速溶（剧烈摇晃） 5ml的离心管中加入4ml的完全培养液（DMEM+抗+血清）即平时用于传代 的10%FBS勺培养液，再加入溶解的细胞液 4.1000rpm,5min,离心，平时常用 900rpm 5min. 弃上清，加入4ml的完全培养液，吹散细胞 分装两瓶中，然后每瓶补充培养液至 5ml/瓶 7.37 C 7.37 C二氧化碳培养箱松盖培养, 二.细胞传代 培养48h内的细胞，若瓶壁上已长满细胞则应进行传代 吸去瓶内的培养液 加入1ml的EDTA让EDTA可以铺过所有细胞，约作用10s 吸去EDTA加入1ml的0.25 %的胰酶，让胰酶没过所有细胞（可轻轻晃动）， 作用约2min。在显微镜下观察细胞，若已由成片的细胞变成单个细胞，则消 化完成 吸去胰酶，加入4ml的培养液。用1ml的吸管吹打瓶壁，让细胞脱落，吹打成 单个细胞悬液 将细胞悬液分成两瓶，并将每瓶培养液补充至 5ml 7.37 C二氧化碳培养箱松盖培养，48h后做传代 .细胞冻存 传代至数瓶的细胞且长满瓶壁即可传代和冻存 把细胞消化（与细胞传代步骤相同），计数。把细胞悬液合并到5ml离心管中, 混匀、1000rpm，离心 5min 弃上清，依细胞数加入培养液（冻存管每管细胞数要达到 4X 106个） 分装到冻存管内（冻存管要预先冷却） 细胞冻存液的成分为：DMSO 100ul培养液600 ul （细胞悬液），血清300ul 将分好的冻存管细胞标上名称、日期等放到冻存盒内拧好 先置于冻存盒内-80 C冰箱中过夜，再转到液氮中冻存 四.分细胞 传代培养至一定数目且生长旺盛的细胞即可分到 12孔板内培养，为下一步转 染做准备 把细胞消化成单细胞悬液计算细胞数 把细胞分到12孔板中，每孔细胞数至少要达到 3X 105个/ ml，并补充培养液 至 1ml/ 孔 3.37 T二氧化碳培养箱松盖培养，24h内做转染（看细胞状况） 五.酶切 酶切体系： 出0 35卩 10X NEB Buffer 10卩 BspQl 3卩 Seal 2卩 Piasmid 50卩 酶切条件： 37 C 10小时 50 r 过夜 电泳鉴定 六.转染（瞬时转染） 12孔板中培养24h内的细胞用于做转染 吸去完全培养基，加入无血清无双抗的 950ul DMEM加入时应轻轻从侧壁加入 加入50ul的转染液（不可晃动） 培养至4-8个小时后换成完全培养液，换液时应轻柔，不可晃动 4.37 T二氧化碳培养箱松盖培养，72h后细胞裂解 注：（1）计算质粒的量，每孔达到lug （2）转染液：新印管中100ul无血清培养基，2ug的质粒，4ul Fugene 七.细胞裂解 转染72h后应取细胞培养液和细胞裂解液检测转染是否成功 吸出细胞培养液到一新的印管中，-20 C保存，待做ELISA 用1ml/孔的1X PBS洗孔，从侧壁加入，轻轻晃动， 除去PBS 加入（PBS+0.3% NP40 500ul每孔，晃动，细胞裂解，此即为细胞裂解液 把细胞裂解液吸到一新的印管中，4500rpm 5min离心，除去细胞碎片和杂质 离心后吸上清（450ul）到一新管中，-20 C保存，待做QT-PCR 注：做QT-PCF前准备（释放 HBV DNA PCRt中：buffer 60ul, 细胞裂解液 40ul PCR仪中：65°C 35min,94 C 17min. 八?鉴定 HBsAg和HBeAg的检测 采用ELISA方法检测HBsAg和HBeAg的表达 荧光定量PCR检测HBV DNA（避光操作） 用蛋白酶K法提取病毒核心颗粒 PCR反应体系： Mix引物1引物2Taq Mix 引物1 引物2 Taq 0.5 卩 l 0.5 卩 l 0.5卩 [1模板 [1 PCR反应程序: TOC \o 1-5 \h \z 94 C 3 min 94 C 15S 60 C 15 S 30 循环 72 C 15S 每个循环采集荧光，程序运行结束后电泳鉴定 传代至一定数目且生长旺盛的细胞即可分到 6孔板进行稳定转染（稳定转染） 1、消化（此时用的培养液成分为：DMEM + FBS） 2、 计数 3、 把细胞分到6孔板中，每孔细胞数要达到至少3X 105，并补充培养液至2 ml/ 孑L, 37C, CQ孵箱， 培养。 24 h内做转染 计算公式:（每孔要加入的消化液体积数X计数的浓度）/2m匸每孔要求的细胞数 例如：计数的浓度为5X 105个/ ml,每孔要求的细胞数为2.5X105个,每孔要求的 总体积为2 ml,则每孔需加如1ml的消化液. 转染（稳定转染） 1、转染液成分配制（每孔）： Opti—MEM 100 卩 l Fugene 5 卩