目的基因c扩增产物的克隆.doc.docxVIP

PAGE PAGE # 目的基因 PCR 扩增产物的克隆 [ 实验原理 ] 1.PCR 产物回收 在高离子盐存在的情况下， DNA 片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列 快速的漂洗、离心的步骤去蛋白液和漂选液，将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除，最后用低盐， 高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净 DNA 从硅基质膜上洗脱。 2.T 载体与 PCR 产物的连接 源 DNA 与载体分子的连接就是 DNA 重组，这样重新组合的 DNA 叫做重组体或重组子。 重组 的 DNA 分子是在 DNA 连接酶的作用下，有 Mg2+ 、 ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切 的载体分子与外源 DNA 分子进行连接。 DNA 连接酶有两种： T4 噬菌体 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。两种 DNA 连接酶都有将两个带有相同粘性末端的 DNA 分子连在一起的功能，而且 T4 噬菌体 DNA 连接酶还有一种大肠杆菌 DNA 连接酶没有的特性， 即能使两个平末端的双链 DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高 T4 噬菌体 DNA 连接 酶浓度或增加 DNA 浓度来提高平末端的连接效率。 T4 噬菌体 DNA 连接酶催化 DNA 连接反应分 为 3 步：首先， T4 DNA 连接酶与辅因子 ATP 形成酶 -ATP 复合物；然后，酶 -ATP 复合物再结合 到具有 5磷酸基和 3羟基切口的 DNA 上，使 DNA 腺苷化； 最后产生一个新的磷酸二酯键， 把 切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为 DNA 片断有两个端点，所以切割时 出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。 对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的 自连接产物。 为了减少自环的高本底， 可对载体进行 5 除磷酸处理， 原理是连接酶只能连接 DNA 片断的 3 OH 末端与 5端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提 供 5 端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自身成环造成的高本底。对于双 酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有 效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。 连接反应的温度在37 C时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳 定的。因此采取折中的温度，即 12-16 C,连接12-16h （过夜），这样既可最大限度地发挥连接 酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 Taq DNA 酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端 都有一个游离的 A碱基，可以与T-Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组 T质粒。 ［实验材料、试剂和仪器］ PCR扩增相关试剂、PCR仪、移液枪、低温离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、 PCR产物回收试剂盒、pUCm-T载体。 ［实验步骤］ 1 . PCR扩增 PCR反应体系： 10 x PCR Buffer 2.5 dNTPs 0.5 口1 Taq 0.2 引物1 1.5 |11 引物2 1.5 ll ddH 20 17.3 l DNA模板 1.5 ll 注：每组做5管，其中4管用于PCR产物回收，1管作电泳检测时的对照 PCR反应程序: 1 94 C预变性 5min 2 94 C变性 45s 3 60 C退火 30s 4 72 C延伸 60s 2 — 4步骤，35循环 5 72 C延伸 10mi n 6 4 C 保存 2 .目的基因PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测 (1 )制备琼脂糖凝胶 称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入 20ml 1.0 x T缓E中液，置微波炉或水浴加热至完全 溶化，取出摇匀，则为 1%琼脂糖凝胶液。 (2 )取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严， 不能留缝隙)。 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 将冷到60 C左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层 均匀的胶面(注意不要形成气泡)。 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。 (6 )加入电泳缓冲液至电泳槽中。 (7)用移液枪将已加入上样缓冲液的 DNA样品加入加样孔中(记录点样顺序及点样量)。 （ 8）接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极， DNA 片段从负极向正极移动）。 DNA 的迁 移速度与电压成正比， 最高电压不超过 5V/cm 。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1~2cm 处， 停止 电泳。 3．产物回收 （ 1）在紫外光下将琼脂糖凝胶上的目的片段切下，放入 1