基因操作的基本技术I电泳技术.docVIP

第三章 电泳技术 实验一 核酸 (DNA或 RNA)的琼脂糖凝胶电泳 一、原理和用途 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 DNA 分子在高于等电 点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方 向移动。在一定的电场强度下， DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子 本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不一样，可进行分 离。 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离 不同相对分子质量的 DNA ，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子。 如 pUCl9 质粒，有 3 种构型： 超螺旋的共价闭合环状质粒 DNA (covalently closed circular DNA ，简称 CCCDNA) ，开环质粒 DNA (open circular DNA ，简称 OCDNA) ，线状质粒 DNA ，即共价闭合环状质粒 DNA 2 条链发生断裂 (1inear DNA ，简称 L DNA) 。这 3 种 构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈 3 条带，超螺旋质粒 — DNA 泳动最快，其次为线状 DNA ，最慢的为开环质粒 DNA 。 琼脂糖凝胶电泳是 DNA 不同长度片段分开常用的方法，根据 DNA 的长度不同， 常用的琼脂糖凝胶浓度也不同（见表 3－ 1） 表 3－ 1 琼脂糖凝胶浓度与可分离的 DNA 长度片段范围 琼脂糖凝胶浓度 (%) 片段可分区域 (kb) 0.3 5～ 60 0.6 1～ 10 0.7 0.8～ 10 0.9 0.5～ 7 1.2 0.4～ 6 1.5 0.2～ 3 2.0 0.1～ 2 二、实验材料 分离纯化的核酸 (DNA 或 RNA) 。 三、溶液与缓冲液 1． 10× TBE 缓冲液 900 mmol/L Tris 900 mmol/L 硼酸 50 100 mmol/L EDTA pH 调至8.0 高压灭菌 用时可稀释为 0.5×或 1× TBE 缓冲液用。 2． 10 mg/mL 溴化乙啶染色液 3． 溴酚蓝电泳加样缓冲液 0.25 ％ 溴酚蓝 0.25 ％ 二甲苯青 FF 40％ （ W/V ）蔗糖水 溶液 4. λ-DNA Marker/ Hind III( 片段： 23.1，9.36， 6.56，4.35，2.32， 2.03， 0.56，0.13 kb) 四、仪器设备及耗材 电泳仪，电泳槽，凝胶板槽，胶梳子，微波炉，电子天平，旋涡振荡器，小型高速 100 离心机， 凝胶成像仪或紫外透射议， 高压灭菌锅， 离心管架， 吸头盒， 2 μ 10 μ L、 L 、 μ 移液器， 10 μL、 200 μ 吸头， 1.5 m L 离心管，胶带纸等。 L L 五、实验方法 1． 将凝胶槽擦洗干净，用胶带纸将两端封住，插上梳子。 2． 0.8 g 琼脂糖悬浮在 100 mL 1× TBE 缓冲液中，微波炉中 2～ 4 min 溶解。 3． 当溶液温度降至 60℃时，加入溴化乙啶溶液，至终浓度为 0.5 μg/mL ，混匀。 4． 立即将琼脂糖溶液倒入胶槽。注意：不要出现气泡！ 5． 等凝胶完全冷却凝固（即约 30～ 45 min ）后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸，将凝 胶移置到电泳槽中。 6． 给电泳槽中加入 0.5×或 1× TBE 缓冲液至高出胶面 2～ 5 mm. 7． 给每个样品加入 5 μL 的溴酚蓝溶液，混匀。 8． DNA Marker ： 18 μL TE 缓冲液， 5 μL 溴酚蓝溶液， 2 μL 0.5 μg/μL λ - DNA Marker/ Hind III, 混匀。 9． 将样品和 λ-DNA Marker/ Hind III ，分别加到凝胶的样品孔中， 一般 DNA Marker 加 在两边。 10． 72 V 电泳约 2～ 5 h 或 36 V 电泳 2～ 10 h。 11． 在紫外透射仪上观察， 如果电泳很好， 可照相， 作进一步分析， 或者作 Southern 印迹等。 注意： 溴化乙啶是一个很强的诱变剂并有中度毒性。使用含有该染料的溶液时，要带上手套，其用后的溶液和凝胶要统一收集处理。 六、作业与思考题 1． DNA 的分子大小与迁移速率的关系如何？ 2． 琼脂糖凝胶浓度对 DNA 电泳有何影响？ 3． 不同构型的 DNA 在琼脂糖凝胶电泳时的速率相同吗？ 51 实验二 核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、原理和用途 丙烯酰胺是一单体结构，由过硫酸胺提供并被 TEMED （ N,