药物分析技术 项目二 液相色谱-质谱联用技术 案例-液质联用测定人血清中的雌酮和雌二醇.doc

液相色谱-质谱法测定人血清中雌酮和雌二醇 1.分析条件 (1)色谱条件:色谱柱为Cadenza CD-C18( 150mm x 3mm,3um);流动相A为乙腈-甲醇(50:50),B为0.1%甲酸;流速为0.4m/min。按下表进行梯度洗脱: 时间/min 流动相A/％ 流动相B/％ 0~5.5 60—90 40—10 5.5~7.5 90—100 10—0 7.5~8.5 100 0 8.5~10 40 60 (2) 质谱条件:正离子方式，电喷雾离子化(ESI),喷雾电压为3300V，雾化气为氮气，气压1.5psi,离子室温度600C，检测方式为SRM。 2.样品处理与分析结果取待测血浆样品0.25 ~1.0ml,加内标溶液(C4雌酮，100pg;C4雌二醇,100pg)，加乙醚4ml,分离上层有机相，挥发至干，残渣溶于乙腈一吡啶溶液中,加入混合试剂(2-甲基-6-硝基苯甲酸酐50mg,4-二甲基胺基吡啶10mg. 吡啶甲酰氯30mg,溶于四氢味喃1ml)0.1ml,加三乙腔0.01ml, 室温放置60分钟,加5%碳酸氢钠0.5ml,转移至C18。预处理小柱(Oeis HLB.含C 18 30mng.使用前分别用甲醇和水Iml处理)上，分别用5%碳酸氢钠1ml、水1ml和5%盐酸1ml冲洗小柱,再用5%碳酸氢钠1ml洗涤，用乙腈-水(80:20,V/V)1mL洗脱，收集洗脱液，在旋转蒸发器中蒸发至干，残渣加乙腈-水(40:60,V/V)1ml溶解.吸取10ul注入液相色谱-质谱联用系统进行分析。雌酮吡啶甲酸酯衍生物和雄二醇二吡啶甲酸酯衍生物的质谱图见图19-9;色请图见图19-10。 3.方法学验证雌酮在10~1000pg /ml, 雌二醇在5~1000pg/ml的范围 内线性关系良好雌酮的平均回收率为92.4% ~110.4% RSD9.9% ;雌二醇的平均回收率为86.2%~114. 4% ,RSD 12.8%。