2.3.1.1 核酸分子杂交.pdf

核酸分子杂交 LOGO 定义 用标记的已知DNA或RNA片段 （探针 ）来检测样品中未知核酸序列 ， 通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合 ，再经显影或显色的方法 ， 将结合核酸序列的位置或大小显示出来。 待测的核酸序列 ，可以是克隆的基因片段 ，也可以是未克隆化的基 因组DNA和组织细胞的RNA。 特点 应用  （1 ）灵敏度高 （1pg  （1 ）基因克隆的筛选 互补序列 ）  （2 ）酶切图谱制作  （2 ）速度快 （24h ）  （3 ）基因组中特定基  （3 ）简单易行 因序列的定量和定性检 测  （4 ）基因突变分析  （5 ）疾病的诊断、微 生物病原体检测 变性 在某些理化因素的作用下 ，核酸双链分子碱基对的氢键断裂 ，疏水 作用被破坏 ，双链螺旋或发夹结构被拆开 ，有规则的空间结构被破坏 ， 形成单链分子 ，称为核酸的变性。 变性 引起变性的因素 热、酸、碱、化学试剂 （如 ：尿素、甲酰胺、甲醛等 ）。 加热变性是最常 用的方法 ，一般加热 80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂 ，双链分开。 变性 变性的核酸分子失去了生物活性 ， 同时理化性质也随之改变 ，其紫外吸收 值 （A260 ）也随之升高。可用紫外吸收 的变化来跟踪DNA的变性过程。以A260 吸收值对应温度作图 ，得到DNA的变性 曲线或熔解曲线。 变性 T m A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解 （melting temperature,Tm) ，此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含 量有关。 Tm = （G+C ）%×0.41+69.3 ，Tm也受介质中离子强度的影响 ，离子强 度低 ，熔解温度也低。 复性 在适当条件下 ，变性DNA的两条互补单链重新结合 ，形成双链的过程称为复性。 在热变性后 ，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时 ，变性的单链DNA即可恢复 双链螺旋结构 ，这样的复性又称为退火。 复性 复性的过程 两条单链随 局部双链形 核两侧序列迅 速配对 ，形成 机碰撞形成 成核 （成核 完整的双链分 局部双链 反应 ） 子 复性 影响复性的因素 单链核 核酸链长 酸的起 度 （分子 始浓度 量 ）