精子特异性离子通道的生理与毒理作用研究.pdfVIP

摘要 摘 要 离子通道调节胞内钙离子浓度和膜电位，并调控多种细胞的生理功能。精子 是一种特殊的细胞，从男性生殖道射出的精子只有经历获能、超活化、顶体反应 等生理变化才能具备受精卵子的能力。而男性生殖道和女性生殖道的离子浓度、 渗透压、酸碱度存在差异，精子适应上述新环境必须要有离子通道的参与，其中 CatSper 和KSper 作为精子特异性的离子通道，在精子成功受精卵子过程中起到 至关重要的作用。 钙通道CatSper 的激活介导Ca2+ 内流，从而细胞胞内Ca2+ （[Ca2+]i ）浓度的 增加诱导随后的获能、超活化、顶体反应等利于精子成功受精。已有报道，CatSper 易于响应外界的刺激，一些内分泌干扰物通过作用CatSper 扰乱精子的功能，而 全氟辛酸（PFOA ）作为主要的环境污染物，其对雄性动物生殖有某种程度的损 伤作用，但PFOA 对人成熟精子的影响及机制还未被报道。另外，通过什么方式 预防和缓解PFOA 诱导的生殖毒性也还没被报道。众所周知，槲皮素（Que ）是 一种具有抗炎症、增强免疫、抗氧化等多种生物学效应的天然物质，被选用缓解 PFOA 毒性的研究。 小鼠精子钾通道KSper 是由主亚基Slo3 介导，Slo3 通道响应胞内pH 碱化 + -/- 开放，K 外流从而控制膜电位的超级化。已有报道，Slo3 小鼠的精子质膜不能 进行超级化而是去极化，并且在精卵结合必要的获能条件下，精子运动异常、精 子尾部类似于 “发卡结构”，未进行顶体反应，更严重的后果是雄性小鼠不育。 KSper 在成熟精子被研究的很充分，但其是否在精子发生中发挥作用还没被报道。 精子发生分为三个阶段：有丝分裂、减数分裂和精子的形成，整个过程生精细胞 的种类主要分为：精原细胞、初级精母细胞（细线期、偶线期、粗线期和双线期 精母细胞）、精子细胞（圆形精子和长形精子）。如果KSper 在生精细胞中发挥作 用，又是哪一个时期呢？由KSper 异常引起的小鼠精子不育，是否可以由精子发 生正常的生精细胞体外培养来弥补。 实验目的：（1）离子通道CatSper 是否是PFOA 毒性的靶点和参与机制；（2 ） 天然物质预防和缓解PFOA 引起的生殖毒性；（3 ）KSper 在精子发生中有什么作 用。实验方法：（1）穿透人工粘性介质和顶体反应检测技术评价PFOA 对人精子 I 摘要 功能的影响；（2 ）钙信号的测定技术评价PFOA 毒性作用的靶点是否和CatSper 有关；（3 ）活性氧产生检测的技术评价是否参与PFOA 扰乱人精子的功能；（4 ） 苏木精-伊红染色染色法用于观察小鼠睾丸组织病理学和附睾精子数的变化，评 定PFOA 对睾丸的毒性及Que 的营救作用；（5 ）实时荧光定量核酸扩增法结合 氧化应激产物和抗氧化酶的定量评定氧化应激的程度；（6 ）免疫印迹法检测细胞 凋亡是否参与PFOA 的毒性作用；（7 ）流式细胞仪检测法：分离不同阶段的生精 细胞，并用GFP 荧光小鼠验证分离的结果。并观察Slo3+/+ 、Slo3+/-和Slo3-/-小鼠 生精细胞的Slo3 表达量、精子的膜电位变化以及Slo3 表达量高的细胞对胞内碱 化的膜电位变化；（8 ）免疫荧光法用于观察 Slo3 在生精细胞中的表达及定位； （9 ）膜片钳实验技术：记录PFOA 及PFOA 和孕酮 （P4 ）联合灌流下CatSper 的电流；在pH 6.0 和胞内碱化条件下，记录粗线期精原细胞和圆形精子Slo3 的 电流，并检测pH 8.0 两种细胞的Slo3 电流。结果：（1）高剂量PFOA （25 µg/ml ） 单独暴露导致人精子穿透人工合成黏液的能力下降，以及其4 h 的连续孵育增加 活性氧（ROS ）的产生；（2 ）PFOA 暴露剂量依赖性激活人精子CatSper ，介导细 胞外的Ca2+ 内流，从而[Ca2+]i 浓度升高。然而，人精子预处理PFOA（2.5-25 µg/ml ） 显著抑制P4 诱导的细胞外Ca2+ 内流；（3 ）PFOA （0.25-25 µ