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未知细菌的鉴定及系统发育分析
为什么要进行微生物鉴定？
▪ 生活中的各种微生物（食品腐败，各种疾病等）
▪ 科研中的微生物
▪ 食品生产行业
▪ 农业植物疾病等
22
形形色色的微生物
33
基本技术
▪ DNA 的分离纯化(Isolation and Purification of DNA) ；
▪ 电泳技术(Gel Electrophoresis) ；
▪ PCR技术( Polymerase Chain Reaction) ；
▪ DNA序列分析技术（Analysis of sequences)
▪ ……
44
研究思路
①、②、③、④、⑤
分子克隆
挑取阳性克隆
总ＤＮＡ提取 16 ＳrDNA扩增 产物纯化 测序
发育地位分析 构建发育树 序列比对 序列处理
5
第I 部分
一、总DNA的提取
（一）原理
▪ 基本步骤
（1）裂解细胞：SDS裂解细胞，EDTA抑制核酸酶。
（2）除去蛋白：蛋白酶K水解蛋白质，酚和氯仿/异戊
醇抽提分离蛋白
（3）析出DNA ：乙醇沉淀使DNA 从溶液中析出。
77
DNA提取的一般流程
88
（二）提取：方法1
4. 向每只EP管加200µL裂解缓冲液(包含40 mM Tris -HCl、20mM pH8.0乙酸钠、
1mM EDTA、质量分数为1％的SDS.) ，用吸管头迅速强烈抽吸，从而悬浮和裂解
细菌细胞。
5. 向每只EP管加入5M NaCl 66µL，充分混匀后，12000r/min离心10min除去蛋白
质及细胞壁等残渣。
99
（二）提取：方法1
6. 将上清液转移到新的EP管中，加入等体积的Tris饱和酚: 氯仿:异戊醇 （25 ：24 ：
1），充分混匀后，12000r/min高速离心5min，进一步沉淀蛋白质。
7. 取离心后的水层，加等体积的氯仿，充分混匀后，12000r/min高速离心5min，
去除苯酚。
8. 小心吸取上清液，用预冷的二倍体积的无水乙醇沉淀，14000r/min离心15min，
弃去上清液。
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附1 ：总DNA检测结果
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