实验植物组织培养.docVIP

实验二十一植物组织培养 实验目的 植物组织培养是60年代以来植物细胞生物学屮发展起来的——项生物技术。它是借用 无菌操作 方法，培养植物的离体器官、组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、 增殖、 分化、发育，最终长成完整再生植株的过程。 植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践屮也已显示了广 阔地 应用前景。组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体疗种、幼胚 培养 与试管受精，抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超 低温 种质保存等方面的深人研究和实际应用，都必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法, 深刻 理解植物细胞的全能性。 实验用品 一、 材料 枸杞、烟草等植物的叶片。 二、 仪器 高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室。 三、用具 锻了、解剖刀、接种针、铝饭盒、锡泊纸、玻璃铅笔或记号笔、橡皮筋。 四、 玻璃器皿 试剂瓶（50、100、1 OOOmi）、三角瓶（100mD、刻度吸管（0?5、1、5、10mi）、培养 皿（直 径 9?llcm）o 五、 药品与试剂 药品（见表21—1） 70%酒精 0. 1%升汞 实验方法 一、培养基的配制 配制培养基前先要配制母液。母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。 （各类成分、 浓度、用量详见表21 — 1）。 大量元素母液（10倍液） 分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约SOOmi热的（60?80C）蒸催 水屮。 （一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水，定容至）0（X）ml后装入试剂瓶屮，冰箱 内贮存备 用。 微量元素母液（100倍液） 分别称取10（）倍用量的微量无机盐，依次溶解于SOOmi重蒸水屮，加水定容到1 OOOmi o 铁盐母液（100倍液） 称取100倍用量的Naz—EDTA＜乙二胺四乙酸钠）和FeSO, ? 7H20,溶于800mi重 蒸水屮，最 后定容到1 000ml。 有机物质母液（100倍液） 分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400mi重蒸水屮，定容至1 OOOmi, 装入棕 色试剂瓶屮，贮存冰箱备用。 除了上述四种母液外，培养慕中经常附加的备种生长素和细胞分裂素也要配成母 液贮存?临 用时按浓度定量吸取加入。 生长素 如2, 4—D、IAA、NAA等。准确称取2（kug,先用2mi 95%乙醇溶解，然后加水, 定容至20mi, 浓度为Img / mi,再放置冰箱内贮存备用。 细胞分裂素 如激动素（K（）、6—节基嚓岭（6—BA）。准确称取20rug,先用2ml的1 mol / LHCI 或 NaOH 溶解，然后加水，定容至20mi,浓度为lmg/mi,再放置冰箱内贮存备用。 （二）培养基的配制与分装 取1 OOOmi烧杯一只,加大量元素10倍母液100ml,微量元素100倍母液10mi, 铁盐100 倍母液10ml,有机物质10（）倍母液10ml。此外，根据培养材料和实验目的还要附加一 定量的生长 索，细胞分裂索及蔗糖等，然后加水至I OOOmi,待蔗糖充分溶解后用I mol / L的NOH 或HC1调 酸碱度为pH5. 8,最后加入琼脂粉6. 5s,如用琼脂条,则要加％。 将盛有培养基的烧杯放入高压锅屮，上盖牛皮纸一张，盖上高压锅盖，蒸煮半 小时左右，待 琼脂完全融化后取出，分装到培养用三角瓶屮，每只100ml三角瓶约装40EI培养基。 分装时要避 免把培养基倒在瓶口上，否则培养时容易引起杂菌污染。 把锡泊纸裁成适当大小的长方形，背靠背折起來，使成正方形，紧密裹在瓶口 上，随后便 可进行灭菌。 培养基的种类和附加成分是根据培养物的种类，外植体的来源以及具体的实验目 的和要求来 确定的。下列经验可作为杞枸叶片培养实验的参考和依据。 MS培养基附加2, 4-D 0. 5mg / L,用于诱导胚性愈伤纟H.织，借以观察体细 胞胚的形成和发 生。 MS培养基附加6—BAo. lmg/L、NAAo. 5mi / L,诱导叶外植体通过体细 胞胚发生途径直接 形成幼苗。 3.. MS培养基附加6—BA O. 5mg / L. NAA 0. 5mi / L,诱导叶外植体通过器 官发生途径序接形 成不定芽。 三种培养基屮附加的蔗糖浓度均为3%。 （三）培养基的灭菌 把装好培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖，关闭放气阀和安全阀，接 通电源，进 行加温，当锅内压力达到3X10 Pa（5磅）时打刃:放气阀，放气5min,使锅内冷空气完 全排出。关 上放气阀，等气压升到9?9X104pa（15磅）时,在9. 9X104?1. 3X10 Pa（15?20磅） 下高压灭 菌15?20rain。断开电源，等高压灭菌锅灭菌后打开放气阀，使锅内蒸气完全