sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)测定蛋白质分子量.docx

实验七 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE测定蛋白质分 子量 实验数据: 标准蛋白质条带 第一条 第二条 第三条 第四条 第五条 溴酚监前沿距离/cm 4.70 距离/cm 「0.50 0.95 1.60「 2.10 3.95 相对迁移率mr 0.11 0.20 0.34 0.45 0.84 分子量Mr [97400 66200 43000 31000 14400 LgMr 4.99 4.82 4.63 4.49 4.16 样品 1 2 3 溴酚监前沿/cm : 4.90 4.80 4.60 样品迁移距离/cm 4.20 1.20 1.70 相对迁移率m厂 0.86 0.25 0.37 标准曲线: 2y=5.05-1.10x 2 y=5.05-1.10x 结果: 样品 1 2 3 Mr 12706 〔59566 43954 mr 4.104 4.775 4.643 实验目的和要求 1学习SDS测定蛋白质分子量的原理。 2掌握垂直板电泳的操作方法。 3运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定。 实验原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分 子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于 温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。 区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海 砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用 聚丙烯酰胺（PAGE和琼脂糖凝胶。 PAGE艮据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效 应。不连续系统中由于缓冲液离子成分， pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电 颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS （十二烷基磺酸 钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂 能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的 SDS溶液中， 与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的 SDS蛋白质复合物，这种复合物由于结合 大量的SDS使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离 子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于 SDS与蛋白质 的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大 小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关 系，符合下式：logMW=K-bX式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若 将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知 蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与 SDS的 结合程度。影响它们结合的因素主要有三个： 1） 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于 1mmol/L时大多数蛋白质与 SDS结合的 重量比为1:1.4，如果单休浓度降到 0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为 1: 0.4 这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与 SDS的充分结合，它们的重 量比应该为1:4或1:3 2） 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是 10? 100mmol/L 3） 二硫键是否完全被还原 三? 实验试剂和器材 材料： 低分子量标准蛋白试剂盒： 低分子量标准蛋白：兔磷酸化酶 B MW=97,400 牛血清白蛋 白 MW=66,200 兔肌动 蛋白 MW=43,000 牛碳酸 酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制 剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌 酶 MW=14,400 开封后溶于200口1蒸馏水，置-20 C保存，使用前室温融化，沸水浴中加热 3-5 分钟后上样。 样品1:称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。 实验试剂 ⑴ 30%丙烯酰胺(Acr):称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 (Bis) 0.8g，加蒸馏水至100ml,过滤后置棕色瓶中， 4 C贮存可用1-2月。 10%SD(十二烷基磺酸钠) 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCI 缓冲液：称取 Tris18.2g , 力口入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8,最后用蒸馏 水定容至100ml。 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl 缓冲液：称取 Tris12.1g，力口 入50ml水，用1m