亚胺还原酶辅酶再生体系的构建及定点突变的研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 亚胺还原酶 （Imine Reductase, IRED ）是一类依赖于辅酶NADPH 的氧化还原 酶，能催化亚胺或酮和胺不对称合成相应的手性胺，且具有立体选择性高、反应 条件温和的独特优势，对于手性胺类药物及其中间体的制备有重要意义。手性胺 类药物临床应用广泛，目前工业上合成手性胺类药物中间体主要采用化学合成或 外消旋体拆分等方法，反应条件较苛刻，步骤繁琐且对环境污染严重。本论文通 过构建IRED 和GDH 共表达菌株，实现辅酶NADPH 的循环再生，降低了亚胺还 原酶催化反应的成本，实现绿色高效合成手性胺。同时，本论文结合蛋白结构分 析和定点突变等生物学手段对亚胺还原酶结构进行改造，探索了获得酶活等性质 优化的突变体的可能性。 在本论文中，来自蜡状芽孢杆菌的亚胺还原酶和来自芽孢杆菌属的葡萄糖脱 氢酶分别被克隆到质粒pET-28a(+) 中，构建重组质粒pET28a-ired 和pET28a-gdh 。 以重组质粒为模板构建共表达质粒 pET28a-ired-gdh ，转化后获得共表达菌株 BL21(DE3)/pET28a-ired-gdh ，诱导蛋白表达后测定酶活分别为68 U/g 和58 U/g 。 以2MPN 为底物，以共表达菌株为全细胞催化剂，优化了反应温度、pH 、有机溶 剂甲醇浓度等影响因素，最终在37℃、pH 为8 时，添加10% 甲醇反应最终转化率 和光学纯度均大于 95% 。底物特异性研究发现该酶无法催化合成索非那新和利伐 斯的明中间体，推测该酶底物结合域较窄或亲和性较差。利用HotSpot Wizard 2.0 分析蛋白结构，预测蛋白的可突变氨基酸位点及可能的有益突变方向，通过全质 粒PCR 构建突变体。酶活检测和生物催化实验结果显示，突变体M192L 相对野生 型酶活升高，但转化率降低，说明该突变体的稳定性有所降低；突变体W196L 相 对野生型酶活和转化率均降低，说明该位点的确为酶活关键位点；突变体 G256A 和 S259G 相对野生型酶活均降低，但转化率与原蛋白相比保持基本一致或有所提 高，推测该位点突变后蛋白的稳定性增强。突变蛋白酶活和转化率的改变是由于 突变氨基酸位点的疏水性和周围环境之间作用力的改变所致。 目前对于亚胺还原酶辅酶再生系统和定点突变相关的研究较为欠缺，亚胺还 原酶的具体催化机制仍需探究。本研究构建了亚胺还原酶辅酶再生体系并优化反 应条件，利用定点突变技术尝试进行酶学性质优化，获得了关键酶活位点，为规 模性生物催化制备手性胺和进一步优化酶的性质打下了基础。 关键词：亚胺还原酶；共表达；定点突变；生物催化；手性胺 I 目 录 目 录 第1 章 前言 1 1.1 手性胺类药物 1 1.1.1 手性化合物 1 1.1.2 手性胺类药物研究现状 2 1.1.3 酶法合成手性胺类药物中间体 3 1.2 亚胺还原酶 4 1.2.1 亚胺还原酶简介 4 1.2.2 亚胺还原酶结构和催化原理 5 1.3 辅酶再生体系的构建 6 1.3.1 辅酶再生体系 6 1.3.2 亚胺还原酶辅酶再生的研究 7 1.4 蛋白活性位点的预测和分析 8 1.5 基因的定点突变方法 9 1.5.1 基因的定点突变 9 1.5.2 亚胺还原酶定点突变的研究 10 1.6 论文研究方法 10 1.7 论文结构11 第2 章 实验材料与方法 12 2.1 实验材料 12 2.1.1 菌种和质粒 12 2.1.2 实验试剂 12 2.1.3 培养基和缓冲液配方 13 2.2 实验仪器 14 2.3 实验方法 14 2.3.