合浦珠母贝PU3及PU6基因的克隆与功能研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 合浦珠母贝是一种重要的珍珠养殖贝类，它的矿化机制也吸引着生物矿化领 域研究者的注意力。本论文针对合浦珠母贝的蛋白质组学及转录组组学的数据进 行分析，筛选出了两种含有纤连蛋白第三结构域的基质蛋白——PU3 及 PU6 。本 研究对这两种蛋白进行了基因克隆和功能鉴定，对这两种蛋白在合浦珠母贝贝壳 的矿化过程中的作用进行了初步的探究。 基于合浦珠母贝转录组及蛋白质组的数据，通过RACE 技术克隆获得了PU3 与P U6 的cDNA 序列全长；运用NCBI 提供的多种软件分析了P U3 及P U6 基因 的cDNA 序列及其对应蛋白的氨基酸序列；通过 qPCR 的方法检测了两种基因在 合浦珠母贝不同组织中的表达情况；利用贝壳损伤实验及RNAi 实验对这两种基因 在贝壳矿化过程中的功能做了初步的探索。 PU3 基因的cDNA 全长为2361 bp ，其中开放阅读框为1857 bp ，编码618 个 氨基酸残基。PU3 的理论分子量为68.73 kDa ，理论等电点为6.53，包含4 个纤连 蛋白第三结构域。PU3 基因在外套膜中高表达。在贝壳损伤修复的过程中，其表 达量会显著上升，并持续维持在一个较高的表达水平。RNAi 实验显示，抑制P U3 基因的表达会改变贝壳棱柱层的结构，边界会变得粗糙，棱柱状晶体中会出现空 洞。根据以上结果推测基质蛋白PU3 在合浦珠母贝棱柱层矿化中起到关键作用。 PU 6 基因的cDNA 全长为2 135 bp ，其中开放阅读框为1863 bp ，编码620 个 氨基酸残基。PU6 的理论分子量为69.09 kDa ，理论等电点为8.74，包含4 个纤连 蛋白第三结构域。PU 6 基因在外套膜中特异性表达，在贝壳损伤修复的过程表达 量会明显上升。RNAi 实验的结果表明，将 P U6 基因的表达抑制后，贝壳棱柱层 的结构会发生明显改变，边界变粗糙且缝隙变大。根据以上结果推测基质蛋白PU6 在合浦珠母贝棱柱层矿化的过程中发挥了作用。 综上所述，本研究证实了基质蛋白PU3 和PU6 在合浦珠母贝的生物矿化过程 中有着一定的功能，并且主要在贝壳棱柱层的矿化过程中发挥作用，抑制其表达 会破坏棱柱层的结构。本研究可以补充对贝壳生物矿化的理解，丰富对贝壳矿化 系统的研究。 关键词：生物矿化；合浦珠母贝；基质蛋白；PU3 ；PU6 I 目 录 目 录 第1 章 前言 1 1.1 生物矿化 1 1.1.1 生物矿化的定义 1 1.1.2 生物矿物 2 1.1.3 生物矿化的过程 3 1.2 合浦珠母贝矿化研究 5 1.2.1 软体动物贝壳的结构 5 1.2.2 合浦珠母贝概述 5 1.2.3 矿化系统 6 1.2.4 矿化机制 6 1.3 矿化相关的蛋白 8 1.3.1 基质蛋白 8 1.3.2 其他相关蛋白 9 1.4 纤连蛋白及其第三结构域 10 1.5 研究目的及意义 12 1.6 论文结构 12 第2 章 实验材料与方法 13 2.1 实验材料 13 2.1.1 实验材料 13 2.1.2 实验试剂 13 2.2 实验仪器 14 2.3 实验方法 15 2.3.1 合浦珠母贝组织总RNA 的提取 15 2.3.2 基因的cDNA 末端快速克隆 15 2.3.3 基因序列的生物信息学分析 22 2.3.4 基因表达组织分布实验 22 2.3.5 贝壳损伤修复实验 24 2.3.6 RNA 干扰实验 24 第3 章 合浦珠母贝PU3