N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的底物特异性改造及高通量筛选方法的建立.pdfVIP

摘 要 摘 要 核苷类似物在医药领域应用广泛。目前许多核苷类似物已被用于治疗癌症和 病毒感染。核苷类似物可以通过化学法和酶催化法合成，N-脱氧核糖转移酶是酶催 化法合成核苷类似物的重要酶之一。 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ （NDT ）通过转移 2-脱氧核苷中的糖基到游离的嘌呤或 嘧啶上，来合成不同的2-脱氧核苷。NDT 的碱基识别范围广，可以识别多种天然 和经过修饰的碱基，因此被用于多种脱氧核苷类似物的合成，如5-氮杂-2-脱氧胞 苷，5-氟-2-脱氧尿苷，曲氟尿苷等，且合成的转化率较高。NDT 对2-脱氧核苷类 底物的糖基有很强的特异性，许多抗病毒的核苷类药物在糖基 2C 和 3C 带有修 饰，如阿糖胞苷，司他夫定，吉西他滨等，NDT 催化合成这些核苷类似物的效率 低，限制了NDT 的应用。因此通过基因突变，改造NDT 的底物特异性，增强NDT 对带有糖基修饰的核苷类似物的催化活性具有重要意义。 为了获得具有2,3-二脱氧核苷或阿拉伯糖苷活性的NDT 突变体，本研究采用 半理性改造的方法，通过序列比对、同源建模、软件结构分析等手段，设计了来自 瑞士乳杆菌的N-脱氧核糖转移酶Ⅱ（LhNDT ）的突变位点。通过定点饱和突变构 建了LhNDT Gly10、Ala11 、Leu96 三个位点的饱和突变体库。 本研究应用 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ-胞苷脱氨酶（NDT-CDA ）双酶共表达和靛 酚蓝比色法，建立了基于全细胞催化的微孔板高通量筛选体系。该体系背景小，灵 敏度和准确度高，可以应用于多种有医药价值的胞苷类似物的检测，如5-氮杂-2- 脱氧胞苷，2,3-二脱氧胞苷，阿糖胞苷。通过突变体库筛选得到一株Gly10Ser 突 变体，具有2,3-二脱氧核苷的催化活性。2 μL 突变体酶液催化10 mM 2,3-二脱氧 肌苷和 15 mM 胞嘧啶，在50 mM, pH 6.0 的磷酸缓冲液体系中反应12 h，合成2,3- 二脱氧胞苷的转化率是野生型NDT 催化反应的5.2 倍。 目前，关于N-脱氧核糖转移酶突变改造的报道较少，本研究通过突变提高了 LhNDT 对2,3-二脱氧核苷的催化活性。建立高通量筛选方法是对酶进行突变改造 的限速步骤，本研究首次建立了 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体的高通量筛选体系， 为NDT 的进一步突变和性质优化奠定了基础。 关键词：N-脱氧核糖转移酶Ⅱ；底物特异性；定点饱和突变；共表达；高通量筛 选 I 目 录 目 录 第1 章 前 言 1 1.1 核苷类似物 1 1.1.1 核苷类似物的概况 1 1.1.2 几种重要的2-脱氧胞苷类似物 2 1.2 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的研究进展 3 1.2.1 N-脱氧核糖转移酶的概况 3 1.2.2 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的结构与催化机理 4 1.2.3 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的应用 5 1.2.4 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ的突变改造 7 1.3 酶分子改造的方法 7 1.4 突变体酶高通量选择/筛选方法 8 1.5 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ酶联显色体系的反应原理 9 1.6 论文研究方法11 1.7 论文各部分主要内容11 第2 章 实验材料与方法 12 2.1 实验材料 12 2.1.1 菌种与质粒 12 2.1.2 主要试剂与材料 12 2.1.3 主要仪器 13 2.1.4 培养基及溶液配方 13 2.2 实验方法 15 2.2.1 N-脱氧核糖转移酶Ⅱ-胞苷脱氨酶共表达菌株的构建 15 2.2.2 蛋白表达与酶活测定 19 2.2.3 靛酚蓝比色法 21 2.2.4 高通量筛选方法的灵敏度和准确度检测 22 2.2