基于相变的甲基转移酶抑制剂高通量筛选方法.pdfVIP

摘 要 摘 要 生物大分子液液分离相变 （相变）是由于生物大分子的多价相互作用而导致 大分子与周围溶液分离的现象。相变过程中，发生相分离的生物大分子会在周围 液态体系中形成一种液滴状结构，类似于油在水中振荡混合后形成的油滴。相变 广泛存在于各种细胞之中，在细胞的信号调节、无膜细胞器组装等生命活动中发 挥着重要作用。相变发生程度及其形成的液滴形态与生物大分子之间的相互作用 直接相关，故本课题通过相变后形成的液滴来指征生物大分子之间相互作用。作 为一种分子开关，甲基化修饰能够改变底物与甲基化结合蛋白之间的相互作用， 因此我们可以通过相变的发生状况来检测底物是否被甲基化。通过与荧光蛋白融 合表达来标记相变体系，我们便能够通过相变中的荧光信号来判断底物甲基化的 状况，从而设计出了高通量的甲基转移酶抑制剂筛选体系。 本课题构建了蛋白质赖氨酸甲基化、DNA CpG 甲基化以及RNA 腺苷N6 甲基 化检测体系，其中蛋白质甲基化检测体系是我们研究的重点。含有 SH3 结构域的 14 聚融合蛋白SMF-GFP-SH3-HP1CD （SGS-HP1CD ）与含有PRM 结构域的14 聚 融合蛋白SMF-GFP-PRM （SGP ）组成蛋白质甲基化检测的初级相变体系，SH3 与 PRM 的相互作用将介导两个多价融合蛋白发生相变。为了解决 HP 1CD 与甲基化 的histone 3 lysine 9 (H3K9) 结合力不强的问题，我们设计合成了由H3 组蛋白N 端 （包含H3K9 位点）和KKETPV 序列两部分组成的底物肽H3K9-KKETPV 。甲 基化的H3K9 能够与HP1CD 相互作用，KKETPV 结构域则能够与6 聚融合蛋白 3HSB-mCherry-PDZ （HM-PDZ ）相互作用。这样甲基化的H3K9-KKETPV 就充当 了SGS-HP 1CD 、SGP 产生的初级相变液滴与6 聚融合蛋白HM-PDZ 的链接，从 而使 SGS-HP1CD 、SGP、H3K9me-KKETPV 和 HM-PDZ 进一步发生次级相变。 通过GFP 标记初级相变蛋白和mCherry 标记HM-PDZ ，我们能够通过相变液滴中 的红色荧光强度与绿色荧光强度的比值Ratio 来判定底物的甲基化情况。我们构建 的组蛋白赖氨酸甲基化检测体系的Z factor 为0.8 左右，表明本体系可用于甲基转 移酶抑制剂的高通量筛选。 关键词：液液分离相变；甲基化；高通量筛选；SUV39H1 I 目 录 目 录 第1 章 前言 1 1.1 液液分离相变概述 1 1.2 生物大分子相互作用研究方法概述 6 1.3 甲基化修饰概述 7 1.3.1 组蛋白甲基化修饰 7 1.3.2 DNA 甲基化修饰 9 1.3.3 RNA 甲基化修饰11 1.4 论文研究方法 13 1.5 论文结构 13 第2 章 实验材料与方法 14 2.1 实验材料 14 2.1.1 细胞与载体 14 2.1.2 试验试剂及耗材 14 2.2 实验仪器 15 2.3 实验方法 16 2.3.1 构建多价融合蛋白的重组质粒 16 2.3.2 蛋白质表达与纯化 17 2.3.3 基于相变的组蛋白甲基化测定体系 18 2.3.4 质谱分析甲基转移酶SUV39H1 活性 19 2.3.5 免疫印迹 19 第3 章 SUV39H1 在大肠杆菌BL21 中的表达与纯化 21 3.1 构建MBP-SUV39H1 原核表达载体 21 3.2 在大肠杆菌中表达MBP-SUV39H1 融合蛋白 22 3.3 镍柱纯化MBP-SUV39H1 融合蛋