SPIN1核仁定位及调控rDNA转录机制研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 核仁是分裂间期细胞核中最为显著的结构，是 rDNA 转录、前体rRNA 剪切加 工、核糖体亚基装配的场所。rDNA 转录是核糖体合成的第一步也是限速步骤，被 细胞内外多种因素严格控制。rDNA 转录水平的少量改变即可影响蛋白质合成，进 而影响细胞的生长和增殖。 SPIN1 是 Spin/Ssty 蛋白家族一员，在卵母细胞发育过程中发挥重要作用。 SPIN1 含有 3 个串联 Spin/Ssty 序列，分别折叠成 Tudor-like 结构域，识别组蛋白 甲基化组合修饰。SPIN1 在多种肿瘤组织中过量表达，能够导致细胞周期紊乱，影 响基因组稳定性，促使细胞发生恶性转化。后续研究发现 SPIN1 是一个核仁定位 蛋白，能够促进 rDNA 转录。然而 SPIN1 如何定位到核仁并参与 rDNA 转录调控 的作用机理仍不清楚。 本论文中，我们首先构建了一系列 SPIN1 点突变和截短突变体，探索介导 SPIN1 核仁定位的关键序列。结果显示 SPIN1 蛋白 N 端存在一个典型的核仁定位 序列 （NoLS ），该序列对其核仁定位和促进 rDNA 转录的功能是必需的。以前的 研究发现，SPIN1 是一个甲基化修饰阅读器，可以识别组蛋白 H3 “K4me3-R8me2a” 组合修饰，促进Wnt 靶基因的表达。我们的结果进一步证明，除了 H3K4me3 ，对 H3R8me2a 的识别也是 SPIN1 发挥 rDNA 转录促进作用不可缺少的，这和 SPIN1 在 Wnt 信号通路中的作用机制类似。在 SPIN1 基因敲低或过表达的细胞中，我们 通过染色质免疫共沉淀实验验证了 rDNA 转录相关蛋白或复合体在 rDNA 区域的 变化。我们发现 SPIN1 能够影响 SL1 （Selectivity Factor 1 ）复合体在 rDNA 启动子 区域的结合，从而调控 rDNA 转录的起始过程。我们同时证明 SPIN1 依赖 H3 “K4me3-R8me2a”组合修饰识别功能，调控 SL1 复合体在 rDNA 上的结合。 综上，我们在一定程度上解答了 SPIN1 核仁定位的谜题，加深了对 SPIN1 核 仁功能的了解；同时也验证了 SPIN1 作为表观遗传调控因子在基因转录中发挥重 要作用。 关键词：SPIN1 ；核仁；N oLS ；组蛋白甲基化；rDNA 转录 I 目 录 目 录 第 1 章 前言 1 1.1 核仁 1 1.1.1 核仁超微结构 1 1.1.2 核仁蛋白的定位 2 1.1.3 核仁 rDNA 转录 3 1.1.4 核仁 rDNA 转录调控 6 1.2 SPIN1 蛋白 9 1.2.1 SPIN1 结构 9 1.2.2 SPIN1 功能 10 1.3 本课题的研究目的和意义 12 第 2 章 实验材料与方法 13 2.1 主要材料 13 2.1.1 细胞及相关试剂耗材 13 2.1.2 质粒 13 2.1.3 抗体 14 2.1.4 分子生化相关试剂 14 2.1.5 实验相关溶液配制 14 2.2 主要仪器设备 16 2.3 实验方法 17 2.3.1 分子克隆 17 2.3.2 细胞培养 18 2.3.3 细胞转染 18 2.3.4 慢病毒包装及细胞感染 18