贝壳再生过程中Shematrin-2的功能及其转录调控的研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 软体动物壳是一种迷人的生物矿物质，它由高度有序的碳酸钙复合物组成。 研究表明，它的贝壳在损坏后可以进行修复再生。该修复过程与贝壳的生长过程 类似，均受到生物大分子，尤其是贝壳基质蛋白（SMP ）来调节。基质蛋白 Shematrin-2 ，其表达水平在外套膜组织中最高，其含量在合浦珠母贝的贝壳中最 高，已被认为是生物矿化的关键参与者，但对其功能及调节机制知之甚少。 在本论文中，我们利用蛋白质组学的方法，鉴定了合浦珠母贝贝壳损伤 5-20 天修复再生的贝壳的SMPs，并比较了新生贝壳与成熟贝壳之间的微观结构差异。 虽然新生的贝壳晶型是方解石，但与再生过程中新生贝壳的微观结构不同，这可 以模拟胚胎幼贝发育过程中贝壳的形成过程。此外，我们从新生的贝壳中发现了 49 个SMPs，包括仅存在于成熟的珍珠层中的一些蛋白质。另一方面，新生贝壳的 基质蛋白还能够在体外影响 CaCO3 晶体形貌，降低晶体的结晶度。这部分工作可 以加深我们对贝壳形成过程的认识。 此外，我们在体外表达并纯化了基质蛋白 Shematrin-2 ，并探讨了其转录调控 的功能和机制。体外功能实验表明，Shematrin-2 可以结合贝壳的方解石、文石和 几丁质组分；降低碳酸钙沉积速度；并改变方解石结晶系统中沉积晶体的形貌。 基于Shematrin-2 基因启动子的序列信息，我们克隆并鉴定了转录因子CCAAT 增 强子结合蛋白（Pf-C/EBPs ）和核因子-Y （NF-Y ）。在瞬时共转染测定中，Pf-C/EBP-A 和 Pf-C/EBP-B 以剂量依赖性方式增强了 Shematrin-2 基因的启动子活性。更重要 的是，通过RNAi 实验敲低Pf-C/EBP-A 和Pf-C/EBP-B 后导致Shematrin-2 基因表 达的降低，并且通过 SEM 观察到的贝壳内表面结构的变化与Shematrin-2 抗体抑 制实验中的结果相似。总之，我们这部分的结果显示转录因子 Pf-C/EBP-A 和 Pf-C/EBP-B 在合浦珠母贝的贝壳形成过程中调控基质蛋白Shematrin-2 基因的表达 水平，这能在分子水平上更好地理解贝壳形成的机制。 综上所述，我们的研究以贝壳再生为切入点探究了贝壳的生长模式，并结合 蛋白组学，对关键的基质蛋白Shematrin-2 的功能及其上游转录调控的机理进行了 探究。本研究为深入探讨合浦珠母贝中基质蛋白基因信号调控网络奠定了基础， 并有助于从宏观及微观结构、蛋白组学、分子水平等多个角度上理解贝壳的形成。 关键词：贝壳再生；转录调控；生物矿化；Shematrin-2 I 目 录 目 录 第1 章 前言 1 1.1 问题的提出 1 1.2 选题背景及意义 1 1.3 文献综述 2 1.3.1 生物矿化概述 2 1.3.2 软体动物的贝壳结构 7 1.3.3 软体动物的矿化系统 14 1.3.4 贝壳的修复再生 17 1.3.5 合浦珠母贝中基质蛋白的研究进展 19 1.3.6 合浦珠母贝中基质蛋白转录调控的研究进展 23 1.4 论文研究方法 27 1.5 论文结构 28 第2 章 实验材料与方法 29 2.1 实验动物 29 2.2 贝壳再生模型的构建 29 2.3 贝壳基质蛋白的提取 29 2.4 贝壳间液蛋白的提取 30 2.5 蛋白浓度的测定 30 2.6 蛋白的质谱（LC-MS/MS ） 30 2.7 Unigene 注释和分类 31 2.8 体外结晶实验 31 2.9 蛋白与文石、方结石和几丁质的结合实验