同位素示踪研究HSP60敲低促进ccRCC发展的作用机制.pdfVIP

摘 要 摘 要 热休克蛋白60 （HSP60 ）是热休克蛋白家族的主要成员之一，其主要功能是在 线粒体中作为分子伴侣帮助线粒体蛋白质折叠或去折叠，从而维持线粒体内蛋白 的稳态。我们前期的研究证明HSP60 在肾透明细胞癌（ccRCC ）组织中低表达， 且HSP60 敲低对293T 细胞和ccRCC 细胞的生长有促进作用。在本研究中，我们 通过分析TCGA 数据库中的临床数据发现ccRCC 中HSP60 低表达和病人的低生 存率相关。通过建立HSP60 敲低和过表达的ccRCC 细胞系, 我们确认HSP60 敲低 促进 ccRCC 细胞的生长,而过表达抑制细胞的生长。为了进一步研究 HSP60 表达 对ccRCC 细胞代谢的影响，我们利用同位素示踪技术，结合代谢组学，蛋白质组 学等手段对HSP60 敲低促进ccRCC 细胞生长的机理进行研究。 首先我们建立了基于高分辨质谱的稳定同位素示踪的非靶向代谢物鉴定方法 流程，该方法利用“Isotopic”程序结合代谢平台的代谢物库可以将被同位素标记上 的代谢物鉴定出来。我们将这个方法应用到293T 细胞进行测试，用13C -葡萄糖或 6 13 13 C -谷氨酰胺进行追踪，分别鉴定到54 或43 个被 C 标记上的代谢物，并发现这 5 些标记的代谢产物主要集中在中心碳代谢通路上。利用这个方法我们发现 HSP60 敲低在 ccRCC 细胞中降低了从糖酵解到 TCA 的代谢流，而代谢组学和蛋白质组 学也发现HSP60 敲低后 ccRCC 细胞发生了Warburg 效应，主要反映在糖酵解过 13 程增强而线粒体氧化磷酸化提供的ATP 减少。 C -谷氨酰胺示踪结果显示HSP60 5 敲低使线粒体增加了谷氨酰胺的利用，从而加强了线粒体生物合成的功能。谷氨酰 胺在TCA 循环中两个方向上的代谢都增强了：Gln→ α-KG→OAA→Asp 和Gln→ α-KG→ISO→ 乙酰-CoA，分别促进了核苷酸的从头合成和脂质的合成。同时，由谷 氨酰胺合成的谷胱甘肽也增加，从而更有效的抑制HSP60 敲低造成的过量ROS 对 细胞的伤害。进一步研究发现HSP60 敲低激活了MEK/ERK/c-Myc 途径促进了谷 氨酰胺酶的表达从而提高了谷氨酰胺代谢，并使得谷氨酰胺酶的抑制剂对 HSP60 敲低的ccRCC 细胞发挥更有效的杀伤作用。 综上所述，我们的结果证明HSP60 敲低促进ccRCC 细胞发生代谢重编程，提 高了线粒体的生物合成功能，使细胞更加依赖于谷氨酰胺为原料的核酸，脂质和谷 胱甘肽的合成从而促进了癌细胞的生长。 关键词：HSP60 ；肾透明细胞癌；谷氨酰胺代谢；同位素示踪 I 目 录 目 录 第1 章 前言 1 1.1 问题的提出 1 1.2 选题背景及意义 1 1.3 文献综述 3 1.3.1 热休克蛋白 3 1.3.2 肾透明细胞癌 9 1.3.3 稳定同位素示踪方法研究进展 17 1.3.4 基于稳定同位素示踪的代谢组学方法 18 1.3.5 稳定同位素示踪代谢组学在癌症代谢研究中的应用 20 1.4 论文研究方法 22 1.5 论文结构 22 第2 章 实验材料与方法 24 2.1 实验材料 24 2.1.1