镜像DNA和RNA的化学测序.pdfVIP

摘 要 摘 要 镜像生物学系统作为一门新生的生物学领域，目前在生物医学等行业展现了 非常大的应用前景。例如它可以用于构建新的镜像中心法则以及用于镜像核酸适 配体药物的筛选。但在这一个领域的发展构建过程中面临着一个重大的阻碍，即缺 乏合适的镜像 DNA 测序技术。尽管如今测序技术已经取得了巨大的发展，但没有 报道表明现有的测序技术是能够应用到镜像 DNA 的序列测定的。由于缺乏特定功 能的镜像酶, 目前大多数测序技术采用边合成边测序方式均不能被用于镜像 DNA 测序。虽然纳米孔测序技术在理论上可以用于镜像 DNA 测序，这一方法仍然需要 一个由 D 构型氨基酸组成的聚合酶或者解旋酶来帮助减缓镜像 DNA 的穿越纳米 孔的速度。 因此我们首先基于 Maxam-Gilbert 测序方法发明了一种可以应用于镜像 DNA 测序的技术。在这一测序方法中，我们首先采用无手性的化学试剂去选择性切割带 有末端标记的镜像 DNA 中的特定碱基，然后用强碱处理使得DNA 链在特定的修 饰处断开，最终通过测序胶技术来实现全长序列的鉴定。在成功建立镜像化学测序 系统之后，我们分别对于镜像 DNA 适配体以及镜像基因进行了测序，并且最终成 功测定了它们的序列。 之后，在我们研究镜像生物学系统的时候，我们意外发现了一个拥有 RNA 依 赖的 DNA 聚合酶活性的镜像酶从而实现了镜像的反转系统。而通过这一反转系统 可以将镜像的 RNA 反转为镜像 cDNA ，然后结合已经建立的镜像 DNA 测序方法 来对其镜像 cDNA 序列进行测定，最终实现了镜像 RNA 的测序。这一镜像 RNA 反转测序技术可以用于分析具有药用价值且不易被核酸酶降解的镜像RNA 适配体 的序列。 综上所述，本论文主要是重建了传统的 Maxam-Gilbert 测序方法，并且成功将 其应用到镜像 DNA 测序中。之后又进一步结合镜像 RNA 反转系统最终实现了镜 像 RNA 的测序。镜像 DNA 和 RNA 的化学测序技术的建立可以帮助构建镜像生 物学系统以及分析具有药用价值的镜像核酸适配体的序列。 关键词：镜像 DNA ；镜像 RNA ；Maxam-Gilbert 测序；手性；镜像适配体 I 目 录 目 录 第 1章 前言 1 1.1 问题的发现 1 1.2 选题背景以及意义 1 1.3 文献综述 2 1.3.1 镜像中心法则 2 1.3.2 镜像核酸适配体概述 5 1.3.3 RNA 测序方法概述 11 1.3.4 DNA 测序方法概述 15 1.3.5 Maxam-Gilbert 测序方法 21 1.4 论文研究方法 23 1.5 论文结构 24 第 2章 实验材料与方法 25 2.1 实验材料 25 2.1.1 本文中的商品化试剂 25 2.1.2 本文中的耗材及试剂盒 26 2.1.3 本文中使用的仪器以及软件 27 2.1.4 本文中自己配制的试剂 29 2.1.5 本文中所使用的引物 31 2.2 实验方法 32 2.2.1 carrier DNA 的制备 32 2.2.2 待测序的 DNA 的纯化 34 2.2.3 化学测序反应 42 2.2.4 其它实验方法 55 第 3章 化学测序反应的重建与条件优化 57 3.1 末端标记的选择 57 3.1.1 Cy5 标记在化学测序反应中的稳定性 58 3.1.2 FAM 标记在化学测序反应中的稳定性 59 3.1.3 镜像 DNA