帽贝齿舌矿化过程中蛋白质组学及功能研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 帽贝是生活在潮间带的海洋软体动物，依靠矿化牙齿刮取岩石上的藻类为食。 齿舌上的矿化牙齿是目前自然界中已知的最硬和最强的生物材料之一，具有重要 的仿生学意义。然而，目前大多数研究只关注其牙齿的超微结构和化学成分，对 其矿化过程分子机理方面的研究非常缺乏，这限制了我们对这种独特和基本的生 物矿化过程的理解与认识。 在本论文研究了帽贝花笠螺（Cellana toreuma）牙齿的微观结构，蛋白质组学 和矿化相关蛋白 CtCBP- 1。微观结构研究发现帽贝齿舌是由三尖齿和单尖齿交替 组成的。牙齿的超微结构显示，在牙齿的尖端和前缘区域矿针尺寸较小，排列密 集无序；相反，在牙齿的后缘和中部矿针排列松散有序且矿针尺寸较大，与化学 合成针铁矿更加类似。首次通过蛋白质组学鉴定齿舌总蛋白质，发现铁蛋白、过 氧化物酶、精氨酸激酶、GTPase-Rabs 蛋白和网格蛋白等具有重要功能的蛋白。不 同矿化程度部位的质谱结果发现，完全矿化部位的特有蛋白含量较少，包括 EGF 结构域蛋白和几丁质结合结构域蛋白；在不完全矿化部位，存在大量的氧化还原 相关蛋白；而未矿化部位蛋白质种类更加复杂多样。针铁矿结合蛋白质组学和 RNA-seq 结果筛选出六种几丁质结合蛋白（CtCBP-1~6）。此外，首次发现从齿舌 牙尖和几丁质框架中提取的蛋白质在体外结晶过程能诱导晶体的堆积，并可能在 体外影响晶体多晶型的产生。另外本论文进一步研究了几丁质结合蛋白 CtCBP-1 的相关功能，首次在体外克隆并表达了该蛋白。体外结合实验发现该蛋白可以特 异性结合几丁质和针铁矿，并且体外结晶实验还发现该蛋白可以改变针铁矿晶体 形貌，引发晶体堆积，但并不改变晶体晶型。同时，荧光标记实验发现该蛋白特 异性结合在牙齿的前缘和边缘处，暗示该蛋白可能参与调控针铁矿的形成和排列。 综通过对花笠螺齿舌矿化过程中蛋白的研究与分析，我们进一步积累并丰富 了齿舌矿化过程蛋白组水平的数据；同时结合体外实验，探究了蛋白质在齿舌矿 化过程的调控作用，加深了我们对生物成因含铁矿物矿化机制的认识，也有助于 为仿生矿化无机物寻找新的生物分子辅助的合成路线。 关键词：帽贝；齿舌；生物矿化；蛋白质组；CtCBP- 1 I 目 录 目 录 第1 章 前言 1 1.1 生物矿化 1 1.1.1 生物矿化的概念 1 1.1.2 生物矿化的类型 4 1.1.3 生物矿化的过程 6 1.2 铁的生物矿化 7 1.2.1 细菌中的铁矿化 7 1.2.2 帽贝与石鳖齿舌的铁矿化 10 1.3 选题背景及意义 23 1.4 论文结构 24 第2 章 实验材料与方法 25 2.1 生物材料 25 2.2 齿舌结构的光学显微镜观察 25 2.3 齿舌结构的扫描电镜观察 25 2.4 齿舌结构的透射电镜观察 25 2.5 齿舌的RNA-seq 25 2.6 拉曼（Raman ）光谱 26 2.7 傅里叶转换红外光谱分析仪（FTIR ） 26 2.8 X 射线衍射（XRD ） 26 2.9 花笠螺齿舌蛋白的提取 26 2.10 齿舌蛋白的LC-MS/MS 质谱鉴定 27 2.11 质谱鉴定结果蛋白的生物信息学分析 27 2.12 齿舌中总RNA 的提取与反转录 28 2.13 针铁矿结合实验 29 2.14 体外结晶实验 29 2.15 RACE PCR 30 2.15.1 RACE cDNA 模板合成 30 2.15.2 CtCBP-1 的RACE 引物设计 31 2.15.3 CtCBP-1 基因的RA