腹泻病毒检测程序.docx

腹泻病毒检测程序 标本收集和处理 采集粪便5 g（5 mL），置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，标本采集后30 min内放入-20 ℃冰箱，如有特殊情况未能及时放入-20 ℃冰箱，标本可在4 ℃短期储存，不能超过2 d，保存期内避免标本发生反复冻融。 制备10%的便悬液：将0.2 g或200 μL粪便标本加到1.5 mL Eppendorf管中，加入标本处理液，震荡3次，每次10 s。然后静置10 min，再以8 000 r/min离心5 min，吸取上清进行下一步试验或-20 ℃短期保存。 A组轮状病毒ELISA检测 采用DAKO轮状病毒ELISA检测试剂盒，具体操作见试剂盒说明书。 核酸提取 采用Geneaid 病毒核酸提取试剂盒和QIAamp?病毒核酸提取试剂盒，具体操作见试剂盒说明书。 A组轮状病毒分型 轮状病毒阳性的标本进一步进行基因分型，毒株分型采用逆转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）进行。 G血清型分型：一次扩增采用编码VP7基因的保守序列设计引物（正链引物BEG9，负链引物END9），扩增基因的片断，二次扩增正链引物为基因保守序列的公用引物（Rvg9），负链引物根据基因内不同血清型的特征序列设计一组分型引物（aAt8、aBT1、aCT2、aDT4、ET3、aFT9），这样从扩增产物的特征分子量大小即可区别轮状病毒的不同血清型。 P基因型分型：其引物设计原理类似，一次扩增引物（4Con3、4Con2）选择VP4基因内的保守序列，二次扩增负链引物选择不同基因型的特征序列，设计一组分型引物（1T1、2T1、3T1、4T1、5T1），正链引物仍采用公用引物（4Con3）。试验所需引物序列和设计扩增产物大小请见表14。 G、P分型的具体实验操作步骤 核酸变性 G分型时，在0.2 mL的Eppendorf管中加入正链引物20 μM BEG9和负链引物20 μM END9各1 μL、RNA模板5 μL、DEPC处理过的水3 μL混合后放在98 ℃超级微量恒温器中变性5 min后，立即放入冰中。P分型时加入的引物则是20 μM 4Con3和20 μM 4Con2，其它加入的试剂均和G分型一致。 逆转录及第一次PCR扩增 4.3.2.1 在上述0.2 mL Eppendorf管中再加入下列物质： ddH2O 22.3 μL 2.5 mM dNTPs 4.0 μL 10×Buffer 5.0 μL 25 mMMgCl2 8.0 μL AMV逆转录酶10 U/μL 0.2 μL Taq酶5 U/μL 0.5 μL 4.3.2.2 放入PCR仪，条件：42 ℃，60 min，98 ℃，3 min 94 ℃ 3 min 94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，10次循环 72 ℃ 7 min 用于轮状病毒分型的寡聚核苷酸引物 引物 G/P分型 位置 引物序列 片段大小（bp） 4Con3 P（+） 11-32 5′-TGGCTTCGCCATTTTATAGACA-3′ 4Con2 P（+） 868-887 5′-ATTTCGGACCATTTATAACC-3′ 877 1T1 P[8]（-） 339-356 5′-TCTACTTGGATAACGTGC-3′ 346 2T1 P[4]（-） 474-494 5′-CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC-3′ 484 3T1 P[6]（-） 259-278 5′-TGTTGATTAGTTGGATTCAA-3′ 268 4T1 P[9]（-） 385-402 5′-TGAGACATGCAATTGGAC-3′ 392 5T1 P[10]（-） 575-594 5′-ATCATAGTTAGTAGTCGG-3′ 584 Beg9 G（+） 1-28 5′-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3′ End9 G（-） 1062-1036 5′-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3′ 1062 Rvg9 G（-） 1062-1044 5′-GGTCACATCATACAATTCT-3′ aAt8 G8（+） 178-198 5′-GTCACACCATTTGTAAATTCG-3′ 885 aBT1 G1（+） 314-335 5′-CAAGTACTCAAATCAATGATGG-3′ 749 aCT2 G2（+） 411-435 5′-CAATGATATTAACACCTTTTCTGTG-3′ 652 aDT4 G4（+） 480-498 5′-CGTTTCTGGTGAGGAGTTG-3′ 583 aET3 G3（+） 689-709 5′-CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG-3′ 374 aFT9 G9（+） 757