生物化学资料：聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离血清蛋白质.pptVIP

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 分离血清蛋白质 实 验 目 的 掌握PAGE分离混合蛋白质的原理 熟悉PAGE的实验方法和操作技术 反应试剂： （1） 丙 烯 酰 胺 （Acr） （2） 甲叉双丙烯酰胺 （Bis） （3） 过 硫 酸 铵 （AP） （4） 四 甲基 乙二胺 （TEMED） （5） 三羟甲基氨基甲烷 （Tris） 实 验 原 理 单体 交联剂 引发剂，提供自由基 加速剂 Acr + Bis PAG AP TEMED 高分子网状结构 反 应 示 意 图 C%(交联度)：Bis占Acr和Bis总量的百分数 凝胶孔径主要由总浓度T%控制 T%值越大，孔径越小 常用的标准凝胶浓度为7.5% 不连续圆盘电泳，有两种不同的凝胶层 分离胶：5%~10%，孔径小 浓缩胶：2%~3%，孔径大，所有离子都能通过 主 要 参 数 T%(总浓度)：100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总质量 聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点 ◆聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续电泳和不连续电泳两类 ◆连续电泳指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔 的孔径都是相同的。 ◆不连续电泳是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的 缓冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳 过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 的三个不连续 聚丙烯酰胺凝胶电泳 的三个效应 凝胶孔径不同 缓冲液pH、离子成分 电位梯度不同 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 三个不连续： （1）凝胶由上下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同； （2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同； （3）在电场中形成不连续的电位梯度。 三种物理效应： （1）电荷效应：蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定的电极以一定的速度泳动。 （2）分子筛效应：分子量、形状不同的分子在经过凝胶孔径过程中，受到的阻力不同，因此移动速率不等。 （3）浓缩效应：使待分离样品中的各组分在浓缩胶中被压缩成层，使原来很稀的样品得到高度的浓缩。 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理 物理效应 样品 ? ⊕ 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 浓缩胶缓冲液 Tris-Cl，pH 6.7 分离胶缓冲液 Tris-Cl，pH 8.9 具有较强的分辨力 缓冲液离子成分的不连续 Cl-快，向前挤，推动蛋白 Gly-慢，阻碍蛋白 电荷不同， 迁移率不同 网孔孔径不同， 大分子受阻 电极缓冲液 Tris-Gly，pH 8.3 电极缓冲液 Tris-Gly，pH 8.3 Gly - Pro - Cl- Gly - Pro - Cl- Cl- Cl- Cl- Pro - Pro - Pro - Gly - Gly - Gly - pH为8.3的电泳缓冲液（Tris-Gly） pH为6.7的浓缩胶 pH为8.9的分离胶 有效泳动率： MCl- M Pro- M Gly- Gly - Gly - Gly - Cl- Cl- Cl- Pro - Pro - Pro - 快离子Cl 慢离子Gly Gly pK1=3.24 pI＝6.0 pK2=9.7 － － 操 作 步 骤 制备凝胶：将玻璃管垂直插于板上，下端必须密闭 加样：将胶管中的水甩干后，加入血清样品15 ?l， 其中含甘油/蔗糖(抗对流，使样品下沉)，溴酚蓝(指示剂)， 样品上部用缓冲液封顶 电泳：2~3mA/管，注意分清正负极 先加入分离胶(长度约10cm )，隔绝空气，静置成胶，再加入浓缩胶(长度约2cm)，最后用水封闭(隔绝空气，使胶面平整) 安装凝胶管：将玻璃管固定于电泳槽中，注入缓冲液 染色和脱色：溴酚蓝染色10min，7%乙酸固定漂洗 剥胶：防止胶柱断裂或破损，一边注水，一边剥胶 Acr和Bis具有神经毒性，避免呼吸道吸入和皮肤接触 注意用电安全，必须先断电，再取出凝胶管 剥胶后管状胶要保存 染液回收 注 意 事 项 相关理论 表-1 血清中各蛋白质的相关特性 种 类 分子量(万） PI 分 布(%) 清蛋白 ?1-球蛋白 ?2-球蛋白 ?-球蛋白 ?-球蛋白 6.9 5.0 9.0 13.0 11.0 6.1 7.3 6.8 7.6 8.0 55 2.1~30.8 4.1~72.5 1.2~25 15.6 前清蛋白 清蛋白 ?2-球蛋白 ?1-球蛋白 ?-球蛋白 ?-球蛋白 观察管状胶条染色条带。 实 验 结 果