生物化学资料：底物浓度及抑制剂对酶促反应速度的影响.pptVIP

底物浓度及抑制剂对酶促反应速度的影响 1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响。 2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响。 3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的km值。 酶动力学实验研究对象 酶促反应初速度 影响因素： 酶动力学实验注意事项 反应pH值 反应温度 反应时间 酶促反应动力学: 影响酶促反应速度(V)的因素: 研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学。 1.底物浓度 [S] 2.酶的浓度 3.温度 4.pH 5.酶的激活剂 6.酶的抑制剂 （一）底物浓度对酶促反应速度的影响 当底物浓度较低时,V随[S]的增大而急剧上升,两者成正比关系.随着底物浓度继续增加,反应速度增加,而幅度不断下降,若继续加大[S]反应速度就不再增加,达到一个极限值Vmax. Vmax [S] (V) [S]与V的关系:米-曼氏方程 Vmax -- 最大反应速度 Km -- 米氏常数 当V＝1/2Vmax时，Km＝［S］ Km值的物理意义:即Km值是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。 Km和Vmax值的测定 (1)测定不同底物浓度的反应初速率，以V-[S]作 图可以得到Vmax，再从1/2Vmax，可求得相应的 [S]，即Km值。 Vmax ? Vmax [S] v Km (2) Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法）是用实验方法测定Km值的最常用的比较简单的方法。 Lineweaver-Burk将米氏方程改写成双倒数形式： （二）抑制剂对酶促反应速度的影响 酶的抑制剂： 抑制作 用类型 可逆性 不可逆性 竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制 凡能降低酶的活性，甚至使酶完 全丧失活性，但不使底物变性的物质。 1.竞争性抑制曲线图 竞争性抑制剂与酶的底物结构相似,与底物竞争酶的活性中心,从而阻碍酶与底物的结合. 特点: （1）V下降，发生抑制 （2）Vmax不变 （3）Km增大，亲和力下降 （三）本次实验方案 碱性 磷酸苯二钠 本次实验以 为底物, 为催化剂, 作为抑制剂，分别观察无抑制剂和有抑制剂时底物浓度与酶促反应速度之间的关系。 磷酸酶AKP 磷酸氢二钠 O-P=O ONa ONa 磷酸苯二钠 + H2O AKP OH HO-P=O ONa ONa + 酚 根据颜色深浅测出光密度值,计算不同底物浓度时A660值（产物的生成量）,以1/A660-1/[S]双倒数作图，获得Km值。 在碱性溶液中，苯酚还原酚试剂应用液中的磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。蓝色的深浅与苯酚的含量成正比，根据蓝色的深浅，可计算出酚的含量。 实验操作 1.米氏常数测定 按下表操作： 管号 试剂（ml） 0 1 2 3 4 5 0.02mol/L底物 0.2 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 蒸馏水 0.8 0.7 0.6 0.5 0.3 0.1 碱性缓冲液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀 37℃ 5′ AKP － 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀 37℃ 15′ （每管准确计时） 酚试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 10％Na2CO3 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 混匀 37℃ 15′ A660 以1/A660－1/[S]作图，求出Km 2.抑制剂对酶促反应速度的影响