利用its序列鉴定真菌.docx

北方民族大学实验论文 题 目： 利用ITS序列鉴定真菌 学 院： 生物科学与工程学院 专 业： 生物技术 班 级： 082 姓 名： 李晓飞 李妍 吾木尔古丽 张瑞莉 陈波 艾克拜尔 指导老师： 刘建利 完成日期：2011年5月18日一一2011年6月5日 利用ITS序列鉴定真菌 李晓飞 李妍 吾木尔古丽 张瑞莉 艾克拜尔 陈波 （北方民族大学 生物科学与工程学院 银川 750021） DNA的提取及琼脂糖凝胶电 DNA的提取及琼脂糖凝胶电 ITS1区）进行扩泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的 DNA ITS1区）进行扩 Gen ba nk比对后，两株菌分 Gen ba nk比对后，两株菌分 别为掷孢酵母属 TY-241菌株（Sporobolomyces s）和假丝酵母 ST-50菌株（Candida sp）。 关键词：ITS序列酵母菌 PCR菌种鉴定 1材料与方法 1.1试验材料与试剂 实验室提供的红色掷孢酵母菌 ［1］和白色产香酵母菌。 YEPD液体培养基［2］配方：酵母浸粉10g,葡萄糖20g，蛋白胨20g，配成1L溶液，分 装 100/250ml , 121 C 灭菌 15min。 裂解液⑶:1L裂解液中需加 Tris1.2114g, EDTA8.767g , SDS5g，用1M的NaOH调至 8.0, 121 C灭菌 30min 备用。 醋酸钾溶液：1L溶液中含醋酸钾245.35g。 氯仿-异戊醇（24： 1 ）：现配现用。 70%乙醇：用95%乙醇配制，现配现用。 10 XTAE 溶液：1L 溶液中含 Tris1.2114g, EDTA29.22g，用 HCl 调 pH 至 8.0。 1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1 TAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次。 1.2主要仪器与设备 表一实验中使用的主要仪器 仪器名称 型号 产地 立式自控咼压烝汽火菌器 LDZX-40SSI 上海申安医疗器械厂 数显恒温水浴锅 HH-4 国华电器有限公司 电泳仪 DYY-12 北京市八一仪器厂 制冰机 AF200PSC50R MSA 生物安全柜 HFsafe 1200/C 上海力申科学仪器有限公司 电冰箱 BCD-219D 青岛海尔股份有限公司 Sigma咼速离心机 3K30 Germa ny 电子精密天平 HR-200 上海精科天平 酸度计 DELTA302 上海 电子可调电炉 101RF-3 天津市泰斯特仪器有限公司 双层恒温振荡器 THZ-9511K 太仓市实验设备厂 紫外分析仪 WD-9403C 北京市八一仪器厂  台式常温高速离心机微量移液器 生化培养箱 基因扩增仪 电泳槽Ce ntrifuge 5415D 多型号LRH-250 台式常温高速离心机 微量移液器 生化培养箱 基因扩增仪 电泳槽 Ce ntrifuge 5415D 多型号 LRH-250 Palm-Cyeler DYCZ-24A Germa ny Germa ny 上海一恒科技有限公司 A gstralia 北京六一仪器厂 1.3实验方法 1.3.1酵母菌的活化及培养 采用本实验楼4楼保藏的红色掷孢酵母菌和白色产香酵母菌 ⑷，先将菌株接于斜面中， 25C培养24h,再转接入三角瓶中 100ml/250ml , 25C培养24h,保存于4C冰箱备用［5］。 1.3.2酵母菌基因组DNA的提取 DNA的提取按照 Makimura等⑹(1994)的方法进行。 ⑴ 用移液器吸取1ml菌液，置于已灭菌的1.5ml的离心管内，常温下 12000rpm离心1min , 弃上清； ⑵加入250 □裂解液； ⑶ 100 C水浴 15min ; ⑷加入250卩l 2.5M的醋酸钾后，置于冰上 30min至1h; ⑸在4C下13000rpm离心5min，上清夜移至一新 1.5ml离心管内； ⑹加入500 ^1的氯仿-异戊醇(24： 1),剧烈振荡，13000rpm，离心15min，移取上清夜至 另一灭菌的1.5ml的离心管内； ⑺重复上一步，直到两相之间没有沉淀，将上清液移至另一灭菌的 1.5ml的离心管内； ⑻加入500卩啲冷的异丙醇，放置在 -20 C静置15min ； ⑼ 13000rpm 离心 15min ； ⑽用1ml70%的乙醇洗涤沉淀； 用1ml70%的乙醇再次洗涤沉淀； 将沉淀置于室温下干燥； 加入50卩1已灭菌的ddHzO，在室温下溶解 2h； 放于-20 C冷藏备用； 1.3.3酵母菌基因组DNA的检测⑺ ⑴制备琼脂糖凝胶：将 10XTAE贮存液用蒸馏水稀释成 1XTAE电泳缓冲液，待用，按1%称 取适量琼脂糖，置于250ml锥形瓶中，加入对应量 1XTAE稀释缓冲液，盖上封口膜，以减少 水份蒸发，放入微波炉里加热