【国自然】基于核酸的重大疾病诊断策略和新技术.docxVIP

项目名称： 依据核酸的严重疾病确诊新战略和新技能研讨 首席科学家： 周翔 武汉大学 起止年限： 2012.1-2016.8 依托部分： 教育部 一、要害科学问题及研讨内容 拟处理的要害科学问题本项目拟处理以下三个科学问题： 研讨癌基因、DNA甲基化基因和骤变基因的结构和生物学规矩，比较它们在疾病和正常细胞中的差异。 处理核酸探针在疾病确诊中的特异性问题，规划、组成和挑选能特异性辨认疾病基因靶点和多位点骤变基因的探针分子。 核酸适配子的高挑选性活络确诊问题。通过化学办法润饰核苷序列或碱基而构成的结构多样性核酸适配子对肿瘤标志物和CTC特异性的辨认能够大大进步，然后进步肿瘤疾病检测的活络度。 2．首要研讨内容： 环绕上述三个科学问题，咱们将展开如下几个方面的研讨： 2.1 致病基因结构与生物学功用研讨 核酸分子的生物学功用由其性质、结构和它们与其它生物大分子的彼此效果所决议。以富G核酸的特别性质为根底，树立模仿基因组DNA杂乱结构下G-四链体结构和构象的解析、示踪和干涉的新技能，挑选和判定与富G核酸、G-四链体彼此效果的小分子。展开上述进程的干涉手法，为重要疾病供应确诊和医治的理论根底。 (1) 研讨生理条件下富G核酸和G-四链体等高档结构的构成条件，以及表现出与疾病相关的性质。 (2) 展开解析生理条件下富G核酸和G-四链体等高档结构构象的技能，为研讨小分子探针与富G核酸和G-四链体的彼此效果供应技能支撑。 (3) 挑选、判定与富G核酸和G-四链体彼此效果的化学小分子，研讨小分子在生理条件下与富G核酸和G-四链体的彼此效果、挑选性辨认及其生物学功用，为疾病确诊和医治供应理论根底。 (4) 富G核酸结构损害检测与损害辨认修正机制，知道致病核酸的结构，寻觅与疾病相关的核酸序列。 2.2 针对致病基因的高活络、特异性小分子的规划与组成 针对癌基因、甲基化DNA、不规矩核酸序列等致病基因的一级、二级和三级结构的特征，研讨化学小分子与它们之间的彼此效果，挑选出结合才能强、挑选性高的化学小分子： (1) 以富含G 核酸序列为靶点（例如，VEGF、BCL-2、Ki-ras 癌基因发动子区和端粒DNA 富G 序列），规划组成和挑选具有辨认功用的新式辨认分子, 如： 氧氮杂环类大环和新式环状寡聚酰胺。在分子、细胞和动物水平上研讨辨认分子对上述癌基因发动子区G-四链体辨认的特性和功用。 (2) 针对DNA 甲基化的基因靶点，首要是寻觅能直接与甲基产生化学反响的小分子，能够到达辨认DNA 甲基化的基因序列的意图。 2.3 分子探针对癌基因、甲基化DNA 和致病基因的辨认与调控 (1) 以癌基因、骤变基因和不规矩核酸结构为靶点，依据化合物的特征性结构， 研讨小分子配体与特别核酸结构的亲和效果，规划挑选出对致病基因序列具有特异的高亲和性化合物，进行光、电、色等功用化基团润饰制备分子探针；在分子水平上了解其效果机制，提醒小分子-核酸间的结构功用联系，在分子水平上了解其彼此效果的特异性。结合细胞生物学，研讨病变细胞和正常细胞润饰电极对特定探针的呼应及呼应的异同点。 (2) 在得到规划组成的探针后，针对DNA 甲基化的基因靶点，运用现有小分子的光或电或色呼应等性质，直接与相关的DNA 甲基化序列效果，通过相关的呼应来检测DNA 甲基化序列. 在细胞水平上， 咱们能够通过运用DNA 微阵列技能和PCR 技能剖析组成的探针分子处理细胞前后基因表达的差异改动，然后发现探针的效果靶基因。运用甲基化PCR 以及bisulfite sequencing 剖析这些基因发动子区域甲基化水平的改动，研讨探针分子对DNA 甲基化基因的影响。 2.4 对乳腺癌、肝癌辨认的核酸适配子的规划与挑选 (1) 运用SELEX 技能自主挑选到的、能特异性结合乳腺癌、肝癌标志物或CTC 的小分子核酸适配子，将核酸适配子与具有光、电、色特征的小分子通过化学办法衔接，树立乳腺癌、肝癌分子确诊新技能。 本研讨将选用的CS-SELEX（Cell surface-SELEX）技能是将肿瘤细胞作为挑选介质的一种新式SELEX挑选办法，例如咱们将表达多天线的杂乱型N-糖苷的肿瘤特异性抗原靶分子的乳腺癌细胞并作为阳性正筛细胞取得靶分子，没有表达靶分子的同系细胞作为阴性反筛细胞消除非靶分子，取得特异性针对乳腺癌肿瘤细胞特异性抗原靶分子的适配子。通过化学核算、分子模仿和分子规划，进行适配子与靶分子对接剖析与自适应辨认研讨，树立相关理论模型，并运用这些模型和机制点评、规划新的核酸适配子分子探针。 (2) 为了处理现在核酸适配子（DNA和RNA）的结构安稳性和特异性，咱们将对挑选到的寡核苷酸结构进行化学润饰，首要在下面几个方面展开相关作业： 针对RNA现在面对的首要问题展开RNA或DNA化学润