酶制剂生产技术(shanchu) 第一模块 酶学基础 课件十二酶的提纯和分离纯化的方法（一）.pptVIP

模块三、酶的分离纯化; ;引入;学习情境十二 酶的提取与纯化;工作任务（一） 酶的提取;提取目标 将目的酶最大限度地溶解出来。 保持生物活性。 提取原则 相似相溶。 远离等电点的pH值，溶解度增加。; 一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 ; 注意事项 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。 一般采用低温下（0-10℃）操作;;沉淀分离 ??心分离 过滤与膜分离 层析分离 电泳分离 萃取分离;沉淀分离;;基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象： 1) 盐溶（salting in） ： 大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象 2) 盐析（salting out） ： 在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。 ;不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。;优点：硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。 缺点：硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。 盐浓度的表示：硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。;调整盐浓度的方式 a.饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液） 适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液 b. 添加固体硫酸铵 适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。;等 电 点 沉 淀;有 机 溶 剂 沉 淀;优点：分辨率比盐析法高 沉淀不需脱盐 溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：容易引起蛋白质变性失活 有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高 ;定义：在酶液中加入某些物质，使其与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离。 常用复合沉淀剂：单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸 ;定义：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。 热变性 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。 pH变性 等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。 有机溶剂变性 使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。; 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。;常速离心机又称为低速离心机, 最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 ;高速离心机 最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～1×105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。 ;超速离心机 最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。 ; 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。 过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。;过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) ;定义：借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。 薄膜类型：主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。 薄膜的作用：选择性地让小于其孔径的物质颗粒或