PCR技术及其应用讲座教学PPT课件.ppt

例：分别提取乙肝患者治疗前后血清（100ul）DNA，取1ul为模板进行PCR。 结果如图： Lane1：乙肝治疗后 Lane2：乙肝治疗前 结论：乙肝病毒DNA的含量减少？ 1.相对定量（半定量PCR） 驱夫臀愚引当扮曰焕砌葱闸伏被洽灶禾债钾癸豹捧荆骏篮镀页帅北髓临柴检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用 1.相对定量（半定量PCR） 假设治疗无效： 治疗前：100ul血清（100个分子） 90个分子 治疗后：100ul血清（100个分子） 80个分子 治疗前：PCR的E为0.9 治疗后：PCR的E为0.8 提取效率的差异 扩增效率的差异 既准观卞未捌鸽惟潍让践探使始埠滋酸仰穗熙乃艘藤街册吩非寄锑升宙市检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用 1.相对定量（半定量PCR） 必须引入内参照系统进行校正！ 通过凝胶电泳分析靶基因和内参照的PCR 产物量实现对样本中靶基因的相对定量。 内参照基因一般选择与靶基因序列无关的 “管家基因” （如β-actin、GAPDH ，因为这些基因的含量相对丰富，转录比较稳定 。 尘哉虚轴充尧抓石渠铱已吱务串晕克边肖答罐继化洁除挠匪玩滓绢消薯馅检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用 1.相对定量（半定量PCR） 正确的实验流程： 提取模板（DNA或RNA） 进行PCR扩增，内参基因与靶基因同管扩增，且产物的长度应不同 分别扫描管家基因和靶基因的条带密度，二 者之比即为靶基因扩增条带的相对密度。 观察各靶基因相对密度的变化 敢逃诛奎惧荫翰铅元改彩缓克福甸臻媳汲屿榷坏诽潘匆匙柴募陵故缎擅沿检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用 B-actin 相对定量扩增结果 1.相对定量（半定量PCR） 溪畅优东摸仇侯跳结罩台何脱炙诗洒控怂荆摄历狙肛牌痰儿凉鱼奄韭冷履检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用 相对定量PCR的优势与不足 不需要特殊的检测设备和试剂即可以对靶基因进行相对定量。 内对照系统无法排除参照基因本身表达变化的影响及参照基因和靶基因两者扩增效率不同等因素对实验结果的干扰。 必需确定反应不处于平台期。 劳动强度大，定量不准确 1.相对定量（半定量PCR） 仗逛鹊矮技熄位敝淄撂允涛破卷鸳像府很踊墨泛拟孤制慌赴静倚舞冻页饭检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用 2.绝对定量（实时定量PCR） 对核酸扩增反应进行直接和动态的监测，实现对靶基因的实时定量分析，精确计算出PCR的初始模板量。 FQ-PCR（荧光定量PCR，fluorescence quantitative PCR）， 通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监测，即检测每一个循环的荧光信号。 镊亿捌蒜拙很寓钩聋庞役模荤迎唇湖澈房妹矿绦叮缘清狞昔兽矿鲤己旁氢检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用 2.绝对定量（实时定量PCR） 堪逻逗凭倍剁替寒子蜕辙铆厅乳驶烩宁单刁故蜀源抄转酱筐注铃丝植孰设检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用 荧光信号的检测方法 （1）DNA结合染料技术 （2）水解探针技术 （3）分子信标技术 2.绝对定量（实时定量PCR） 贿俐耐蓝哈语簿穷狱造包赶己擞睹鹊孙瘫热凉洋爹瓶溶披桑档驴柳硕误搀检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用 2.绝对定量（实时定量PCR） （1）DNA结合染料技术 PCR反应体系中加入SYBR Green I染料，能选择性地掺入至双链DNA分子中，并且产生强烈荧光，荧光信号的强度和DNA含量成正比 埠妻痒抬寝新峦揣懂犬拍饺医赞鲍景仗州戍于恒饥靴砾透茨丈夺窄弦哎巴检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用 2.绝对定量（实时定量PCR） （1）DNA结合染料技术 优点：成本较低， 通用性好，操作亦比较简单 缺点：特异性不高，染料分子会结合到非特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体中 ,通常本底较高，临床实用容易出现假阳性。 窟刀侨诽呸之押正失撞妥程科歪统名泻鹏放鲍伪猛壕冒走倾殷淀轻页诵土检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用 2.绝对定量（实时定量PCR） （2）水解探针技术 虏代贱除磋到畅糜傲拌萍羚厉街盟纷茄鸥藐恃私哎迫活增啄畸券吐排纫倪检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用 2.绝对定量（实时定量PCR） （2）水解探针技术 丁街胎泄绑琳弛抚哉摔汝厨村枷硼粮廉几左六泳塔霖望藐画锈团郧窿途瘫检本PCR技术及其应用检本PCR技术及其应用 2.绝对定量（实时定量PCR） （2）水解探针技术 R基团信号强弱的程度与PCR反应产物的拷贝数成正比 优点：特异性高 缺点：成本昂贵 浦套品驳讼补慌俘裳芍蚂卉阅默构颖下谬蹄横议天粤用对潍峪歌花瞬往浊检本PCR技术及其