猪牙皂皂苷抗肝癌作用机制的研究及其微球制剂的制备.docxVIP

猪牙皂皂苷抗肝癌作用机制的研究及其微球制剂的制备 目的 : 本课题通过国内外文献调研和药理实验研究发现我国传统中药猪牙皂 具有明显的抗肿瘤作用 , 其主要活性成分是三萜皂苷类化合物 sup[1-6]/sup 。 在前期研究的基础上 , 本课题拟采用中药化学分离、纯化和药理实验相结合的活 性跟踪法制备猪牙皂皂苷 , 通过药理实验探讨猪牙皂皂苷（ SFGS）是否具有抗肿 瘤作用以及是否具有对索拉非尼的化疗增敏作用 , 并阐明其可能的药理作用机制。 由于猪牙皂皂苷气味辛辣 , 对人体黏膜有一定刺激性 , 为方便猪牙皂皂苷的 临床应用 , 本课题考虑以壳聚糖为载体材料制备猪牙皂纳米微球 , 并进行表征测 定和药效学评价。方法 : 试验一猪牙皂皂苷类化合物的分离纯化及抗肝癌活性研 1. 进行猪牙皂总皂苷提取方法的研究 , 考察各单因素（提取方法和提取溶剂）对猪牙皂总皂苷提取率的影响。 称取 50 g 猪牙皂 , 制备总浸膏 , 用大孔吸附树脂法分离纯化 , 通过皂苷的检识反应和体外抗肝癌药理实验 , 进行活性部位的筛选。 3. 称取 29 kg 猪牙皂 , 按照优化后的提取工艺制备猪牙皂总浸膏 , 并用大孔吸附树脂法分离纯化。 根据预实验结果 , 选取药理活性最好的洗脱部位 , 用硅胶柱层析法分离纯化（洗脱剂为二氯甲烷 - 甲醇溶剂体系）, 并对各洗脱部位进行体外抗肝癌活性筛选。 选取药理活性最好的硅胶柱洗脱部位 , 用 MCI柱层析法分离纯化（洗脱剂为乙醇 - 水溶剂体系） , 并对各洗脱部位进行体外抗肝癌活性筛选。 选取药理活性最好的 MCI 柱洗脱部位 , 进行质谱分析 , 对里面的成分进行结构鉴定 , 然后用紫外分光光度法测定皂苷含量。试验二猪牙皂皂苷与索拉非尼联用抗肝癌药理作用机制的研究 1. 通过体外抗肝癌药理实验验证猪牙皂皂苷与 索拉非尼联用是否具有协同增效作用。 用免疫印迹法（ Western Blot,WB ）法检测在不同给药情况下 , 肝癌细胞中凋 亡相关蛋白（ cleaved caspase-3 、 cleaved caspase-9 ）的表达水平。 2. 通过 WB法检测内质网应激（ ERS）相关蛋白（ GRP78、CHOP）的表达水平 , 验证猪牙皂 皂苷是否能够激活肝癌细胞的 ERS。 通过体外抗肝癌药理实验和 WB法检测 ERS是否能够影响猪牙皂皂苷对索拉 非尼的化疗增敏作用。 3. 通过 WB法检测 Wnt/β-Catenin 信号通路相关蛋白 GSK-3β、β-catenin 、TCF-4）的表达水平 , 验证猪牙皂皂苷是否能够抑制 Wnt/ -Catenin 信号通路。 用β -Catenin 特异性抑制剂（ XAV939）处理肝癌细胞并进行相关检测 , 验证 抑制 Wnt/ β-Catenin 信号通路是否能够诱导肝癌细胞凋亡。 4. 通过体外抗肝癌 药理实验和 WB法验证猪牙皂皂苷是否通过激活 ERS介导 Wnt/ β-Catenin 信号通 路。 用内质网应激激活剂（ Thapsigargin,TG ）处理肝癌细胞并进行相关检测 , 验证 ERS是否能够介导 Wnt/β -Catenin 信号通路。 5. 建立 H22荷瘤小鼠模型 , 验证猪牙皂皂苷与索拉非尼联用的体内抗肿瘤作用。 试验三壳聚糖 - 猪牙皂皂苷纳米微球的制备及抗肿瘤作用研究 1. 选择壳聚 - 猪牙皂皂苷纳米微球的制备方法 , 并进行纳米微球制备工艺的研究 , 以外观、粒径、 PDI、 Zeta 电位和包封率为评价指标 , 考察各单因素对纳米微球剂型的影响。 2. 制备壳聚糖 - 猪牙皂皂苷纳米微球并进行表征测定。 建立 H22 荷瘤小鼠模型 , 验证壳聚糖 - 猪牙皂皂苷纳米微球与索拉非尼联用的体内抗肿瘤作用。结果 : 试验一猪牙皂皂苷类化合物的分离纯化及抗肝癌活 性研究 1. 经过比较 , 提取溶剂为 75%乙醇 , 提取方法为加热回流法时 , 猪牙皂皂苷 的提取率最高。 通过泡沫试验和醋酐 - 浓硫酸反应 , 可知皂苷类化合物主要存在于大孔吸附树脂柱的 30%乙醇洗脱部位和 70%乙醇洗脱部位 , 且皂苷的主要类别为三萜皂苷。通过体外药理实验 , 证明 70%乙醇洗脱部位的抗肝癌活性最好。 通过体外药理实验 , 可知硅胶柱的二氯甲烷 - 甲醇（ 2:1 ）洗脱部位抗肝癌活性最好。 4. 通过体外药理实验 , 可知 MCI 柱的 60%乙醇洗脱部位的抗肝癌活性最好。 将 MCI柱的 60%乙醇洗脱部位进行质谱检测 , 通过结构分析 , 鉴定了 17 个 三萜皂苷类化合物 , 然后通过香草醛 - 高氯酸显色法测定皂苷含量 , 可知皂苷含量 77.4 ±2.1%。试验二猪牙皂皂苷与索拉非尼联用抗