斑点叉尾鮰病毒感染及鲶科鱼(斑点叉尾鮰和黄颡鱼)的免疫特性.docxVIP

斑点叉尾鮰病毒感染及鲶科鱼 （斑点叉尾鮰和黄颡鱼） 的免疫特 性 鲶科鱼类广泛分布在除南极洲以外的其他大陆上 , 在世界各地被养殖了好几 个世纪。鲶科鱼类作为世界鱼类产业的重要物种 , 具有较高的市场价值。 鲶科鱼类在养殖过程中饱受病毒和细菌疾病的侵害 , 造成了严重的经济损失 , 影响其产量。学者们报道了几种能大规模造成鲶科鱼类死亡和发表的病毒和细菌 性疾病。 目前认为鱼类通过建立物理和生化免疫系统来应对入侵的微生物。然而 , 免 疫系统组成成分十分复杂 , 相关酶和信号通路会有效的保护鱼体。 已从鲶科鱼类中分离出多种免疫相关蛋白和酶 , 它们的免疫活性在包括黏膜 层和分泌物在内的各种器官中被阐明。 本研究报道了斑点叉尾鮰在受到斑点叉尾 鮰病毒 (CCV)感染后的免疫应答反应 , 和重组激活基因 2 (RAG2)的发现及在黄颡 鱼中的抗菌作用。 此外 , 还在黄颡鱼中发现了一种炎性因子 CYPA并研究了其在粘膜免疫的作 用。斑点叉尾鮰病毒 (CCV)可以对斑点叉尾鮰幼鱼造成致死性感染 , 从而导致巨大 的经济损失。 CCV的基因组已经完成测序 , 其患病率是有据可查的。然而 ,CCV致病的分子 机理却很少有报道。 在此 , 斑点叉尾鮰卵巢细胞 (CCO)感染 CCV后, 利用 RNA测序技术分析转录组 草图。总的来说 , 从个测序读取中得到个清洁读取 , 这些序列 进一步组装为 747168 个 contigs 。 把这些 contigs 拼接成 49119 个单基因簇 , 其中 20912 个单基因簇可以在 NR 数据库中找到 , 并匹配到 15911 个蛋白质 ,18333 个序列可以在 SwissProt 数据库 发现 , 并匹配到 14625 独特的蛋白质。 与对照组相比较 , 我们从中发现了 3641 个 差异表达基因 , 包括 260 个上调基因和 3381 个下调基因。 为了验证这些基因的表达 , 我们采用 qRT-PCR技术分析了 16 个差异表达基 因。对差异表达基因及其相关的细胞信号通路进行分析显示 , 这些差异基因确实 CCV感染后引起的细胞凋亡相关 , 细胞凋亡的发生进一步用标准的细胞凋亡实验来阐明。 结果表明 , 在斑点叉尾鮰卵巢细胞中 ,CCV可以诱导肿瘤坏死因子 (TNF) 介导外源性凋亡途径 ( 而不是线粒体内源性凋亡途径 ) 。这项研究有助于我们认识 CCV 发病机制 , 同时有助于预防斑点叉尾鮰受到 CCV感染。 重组激活基因 2 (RAG2)与 RAG1一起调节了 V (D) J 免疫球蛋白重组 (IG) 和 T 细胞受体 (TCR)基因。 RAG2是一种脊椎动物适应性免疫反应的关键因子 , 解 析 RAG2功能特性有助于了解它在黄颡鱼中对病原体的生物应答。 在本研究中 , 黄颡鱼的 RAG2基因已经被成功克隆和鉴定 , 并且研究了它的表 达情况。结果显示 , 黄颡鱼 RAG2基因的开放阅读框 (ORF)有 1596 bp 大小 , 编码了 531 个氨基酸 , 分子量为 59.86kDa。 与其他物种进行多序列比对和系统进化分析表明了它的保守区和经典分类 学和进化。我们检测 RAG2蛋白的表达以及制备了 anti-rag2 兔多克隆抗体。 随后 , 在不同组织中对其转录水平和蛋白水平进行了检测 , 其中 , 胸腺组织、 脾脏和头肾具有相对较高的表达水平。 此外 , 经爱德华氏菌感染后 , 在淋巴组织中观察到重组激活基因 (RAG2)、白细胞介素 1 β (IL-1 β ) 和肿瘤坏死因子 - α (TNF- α) 的表达。 我们的研究表明 , 在黄颡鱼中 ,rag2 可能参与了对细菌感染的免疫应答。鱼 的皮肤黏液是抵抗病原体入侵与多种抗微生物酶的动态屏障 , 包括亲环素 A(CypA), 一种具有肽基 - 脯氨酰顺反异构酶 (PPIase) 活性的多功能蛋白。 除了各种免疫功能 ,CypA 可以诱导硬骨鱼类白细胞体外迁移。 在目前的研究 , 通过质谱分析法 , 我们在黄颡鱼皮肤粘液中已经发现了几种新的免疫相关蛋白。 我们用蛋白质印迹的方法在其中检测到了 CypA 基因。在皮肤粘液中 ,CypA 对黄颡鱼白细胞有很强趋化活性。 有趣的是 , 在黄颡鱼 CypA基因中 , 第 69 个氨基酸位点天冬酰胺 ( 类似哺乳动 物中的精氨酸 ) 对于白细胞的吸引是非常关键的位点。这些发现不仅解释了皮肤 粘液中多种酶的结构 , 同时说明了 CypA 基因是抗炎症治疗法的关键因子。