基因测序的原理及应用.pptx

基因测序的原理及应用讲 课 大 纲一、基因测序的原理基因结构和基因序列、核酸分离纯化和保存、PCR技术和应用二、一代测序技术和临床应用一代测序技术、单基因遗传病的基因检测三、二代测序技术和临床应用二代测序技术、panel测序和全外显子组测序讲 课 大 纲一、基因测序的原理基因结构和基因序列、核酸分离纯化和保存、PCR技术和应用人类基因组的结构特点大小：全长：3.2 × 109bp（3200Mb）基因序列占：1.2 × 109bp（1200Mb）基因间序列占：2.0 × 109bp （2000Mb）基因平均长27kb，平均9个外显子/基因，编码序列平均1340bp/基因特点：编码序列仅占1%；非编码序列98%以上；重复序列多。目前，人类基因组中的蛋白质编码基因数目：20500个（Clamp M. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Dec 4;104(49):19428-33）真核生物基因结构调控序列调控序列结构基因promoterPoly(A)加尾信号CAAT boxTATA boxEnhancer5’-UTRexonexonexon3 ′intronintronresponseelement5 ′TGAATG+1Stop中心法则及其发展复制复制转录DNA RNA逆转录翻译蛋白质基因控制性状的两种途径：基因通过控制酶合成控制生物体的性状基因通过控制蛋白质的结构控制生物体的性状基因、环境与性状的关系生物性状是由基因与环境综合作用的结果基因突变导致疾病表型眼白化病-GPR143基因突变控制酶形成的基因异常Type-1型-TY RType 2型-OCA2Type 4型-SLC45A2酶异常 酪氨酸酶合成异常控制酪氨酸酶的基因黑色素形成障碍代谢异常酪氨酸酶酪氨酸黑色素黑色素缺乏-白化病白化表型人类DNA序列变异（variation）包括：DNA的多态性(polymorphism)：某些DNA序列在人群中出现的频率1%，有的与疾病相关基因的突变(mutation)：出现频率1%，引起基因功能的显著改变，导致人类遗传病或不致病DNA三类常见的 多态性（frequency 1%）变异类型概念基因组中的频率基因组中约有1000万个给定人群中基因组的给定位点的单个SNPSTR核苷酸变异，人群中出现的频率1%可变数目为1-6bp核心单元组成的重复 基因组中至少有100万个，序列，长度一般200bp 约占人DNA序列的3%基因组中从≥1kbp到≥Mb不等的DNA片 目前尚不清楚，估计段的拷贝数变异，包括倒位、缺失、 ≥50kbp的CNV约占DNA插入、重复等方式。人群中出现频率 序列的12%1%时称拷贝数多态性CNV8常见基因突变类型动态突变大片断突变点突变同义突变错义突变剪接突变启动子突变无义突变移码突变三联体重复扩增缺失插入重排突变与蛋白活性的关系：? 遗传密码改变? 蛋白肽链中的片段缺失? mRNA剪接错误? 影响mRNA修饰? 影响基因表达常见基因突变突变类型概念生物学效应仍编码相同的氨基酸同义突变发生在三联密码子的第三位碱基错义无义突变涉及三联密码子前两位碱基中的一个 氨基酸发生改变，可影响蛋白活性中心，也可无影响突变使编码氨基酸的密码变成终止密码子 多肽链合成提前终止，通常产生无活性的多肽链点突变位于内含子与外显子交界处，可影响RNA 降低剪接效率或产生异常剪接子，抑剪接突变剪接的突变制正常基因表达启动子 突变位于基因调控元件结合处区突变影响该基因的转录突变位点以下的氨基酸序列发生改变，可使蛋白质失活或功能异常移码突变插入、缺失非三的整倍数的碱基部分结构基因序列丢失造成编码基因序列重排，也可使整个基因缺如缺失数十到数百个碱基对缺失若插入发生在结构基因，序列将发生插入一段数十到数百个bp DNA片段，可来源于同一染色体，也可来自其他染色体 重排，导致基因表达失活或激活插入插入重排或外源基因DNA缺失或插入引起，或由于基因扩增使 通常可使基因表达产物剂量增加，导基因序列发生大的改变 致细胞功能的紊乱位点附近的基因10DNA突变与基因功能的改变? 单倍剂量不足（haploinsufficiency）? 显性负效应（dominant negative）? 反义RNA转录/基因组修饰? 转录因子基因突变? 影响mRNA稳定性? 转录增强作用? 增强子的位置效应? 剂量效应? SNP创造新启动子? 获得性RNA堆积基因测序的基本流程? 抽提核酸-扩增（建库）-测序-分析? 一代测序：抽提核酸-PCR扩增-电泳检测PCR产物-毛细管电泳（Sanger测序）-数据分析? 二代测序：抽提核酸-目标区域捕获-各种方式建库/扩增-各种平台大规模平行测序-数据分析? 两种方法的测序原理与数据分析不同核酸提取细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀