Sanger测序的基本原理、过程及注意事项.pptx

Sanger测序的基本原理、过程及 注意事项 内容提要 一、Sanger测序的基本原理 二、Sanger测序的基本操作流程 三、Sanger测序的注意事项及常见问题 3,5-磷酸二酯键 5’ 磷酸 脱氧核糖核苷酸通过形成3’，5’-磷酸二酯键延长DNA的链 化学原理：双脱氧末端终止法 无3’ OH的ddNTP阻止下一个dNTP的掺入 测序PCR的过程 测序反应的延伸阶段，ddNTP在不同位置掺入产生一系 列不同长度的新的DNA片段。 内容提要 一、Sanger测序的基本原理 二、Sanger测序的基本操作流程 三、Sanger测序的注意事项及常见问题 Sanger测序的基本操作流程 ExoSAP-IT 酶纯化 大约40分钟 大约2小时 配制测序PCR体系进行测序PCR反应 测序PCR产物的纯化 大约1小时40分钟 上机进行测序分析 ExoSAP-IT 酶纯化 ExoSAP-IT酶是一种复合酶，包括两种水解酶：外切酶Exonuclease I 和虾碱性磷酸酶 虾碱性磷酸酶 Exonuclease I 残留的引物及任何在PCR 中产生的外来单链DNA 配制测序PCR体系进行测序PCR反应 Reaction DNA 1/8x 1uL 1/16x 1uL 引物(3.2 pmol/μL) BigDye (2.5x) Seq Buffer (5x) 去离子水 1uL 1uL 0.5uL 1.75uL 5.75uL 10uL 0.25uL 1.875uL 5.875uL 10uL 总体积 BigDye的终浓度：(2.5x ×0.25 μL + 5x ×1.875 μL ) / 10 μL = 1x 测序反应完成后存在什么？ 残留的荧光标记的ddNTP 为什么要进行测序产物纯化？ 1、测序反应只消耗一小部分荧光标记的ddNTP(BigDye® Terminator） 2、残留的BigDye会随测序产物一起进入毛细管迁移，导致错误的碱基判 读 测序PCR产物的纯化 酒精/EDTA/NaAc 法 • 每管加入1 μL 125 mM EDTA(pH=8)，1 μL 3 M NaAc(pH=5.2)，加到管底； • 加入35 μL 100% 酒精，封严，震荡4次，室温放置15 min； • 3700rpm 4 °C离心30 min，马上倒置96孔板， 离心至850rpm停止离心； • 加入50 μL 的-20°C预冷70% 酒精，3700rpm 4 °C离心15 min，马上倒置96 孔板， 离心至850rpm停止离心； • 重复用预冷70%酒精洗涤1次； • 让残余的酒精在室温挥发干，加入10 μL Hi-Di甲酰胺，95 °C变性4 min， 迅速置冰上4 min ，上样电泳。 内容提要 一、Sanger测序的基本原理 二、Sanger测序的基本操作流程 三、Sanger测序的注意事项及常见问题 样品准备问题 • 没有进样 • 进样过多 • 多种测序产物 • 测序引物质量差 没有进样 图2 分析后的数据 图1 原始数据 进样过多 • 由于模板太多或者测序反应太强导致信号过强 • 在原始数据里，如果信号强度超过正常范围，软件将不能正确地分析 数据； 注意：测序信号过强或者进样太多将导致测序数据中PCR产物中的 劈峰(Split Peaks)和pull up峰(peaks under peaks)出现。 进样过多——模板太多 如果样品中含有太多的DNA，荧光标记的ddNTP就会很早结合上去，出现 “头重”的现象。数据前面信号很强，随着反应进行信号变弱导致测序读长变 短。调整DNA模板的量通常可以避免这种现象。 进样过多–pull down峰 上图为进样太多的原始数据，信号非常强的区域出现pull down峰(负峰) 进样过多–pull up峰 峰的底部出现可辨别的峰。如果采用错误的spectral/matrix 或者由于光路改变 需要重新做spectral校准时也会发生类似情况。 多种产物 多种产物 可能原因： • 非特异PCR产物或测序产物 • 多克隆 • 可能存在插入缺失突变 • 水/环境的污染 • Septa污染 测序引物质量差 引物合成时部分引物多一个碱基（N+1） 其他常见问题 • 检测出渗漏的错误信息 • 数据中出现钉子峰 • 拖尾峰 • 放电现象 胶中的气泡引起钉子峰 原始数据图谱。左边的图是右边显示窗口中钉子峰图的放大图。注意所有四种 颜色都在一个很窄的钉子峰中出现 ，有别于胶和DNA中出现的峰。 拖尾峰- 可能需要更换毛细管 四种颜色都出现拖尾峰通常是毛细管损坏最初的信号，表明需要更换毛细 管。 也可能是pH变化、氧化、温度变化或者是暴露在光下造成的。 拖尾峰- 只有碱基C拖尾 只有C或G峰拖尾通常是由于pH变化、氧化、温度变化或者