细胞培养全攻略.docVIP

基础篇-无菌操作基本技术 实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminar flow）以紫外灯照射30-60分 钟灭菌，以70 %ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，II即使培养基相同亦不 共亨培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物甜带出工作 台，以70 % ethanol擦拭无菌操作抬而。操作间隔应让无菌操作台运转10分 钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器 或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用甜用完即应移出，以利于气流之流通。实 验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬而Z屮央无 菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口， 亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身， 倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于來自 人类或是病毒感染Z细胞株应特别小心操作，并选择适卅等级Z无菌操作台（至 少Class II） o操作过程中,应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品,例如 DMS0及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。屮，应避免引起aerosol之产生， 小心毒性药晶，例如DMS0及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。 定期检测下列项co2钢瓶之co?压力；co2培养箱Zea浓度、温度、 及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，毎周更换）；尢菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300小吋/预滤网，3000 小时/IIEPA） o 6?水槽可添加消毒剂（Zephrin 1:750）,定期更换水槽的水。 基础篇-实验用品 种类： 1.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet夕卜，其它均 为塑料无菌制品。 1.2. TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类 有 Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 3. plastic st erile pipet: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml 4.塑料离心管：15 ml, 50 ml,均有2种不同材质，其I* polypropylene (P P)为不透明材质，polystyrene (PS)为透明材质，可依实验需要而选择适合材 质之离心管。 glass pastuer pipet: 9 inch,用以抽掉废弃培养液等。 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware): 100 ml, 250 ml, 500 ml, 100 0ml 清洗： 1.新购玻璃血清瓶先以0. To. 05 N HC1浸泡数小吋，洗净后才开始使用。 2.用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水 冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 灭菌： 1.实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121°C, 15 lb, 20 分钟,置于oven中烘干。 2.实验用玻璃pasteur pipet以干热灭菌170°C, 4小时。 3. 3.液体或是固体废弃物可用10 % hypochioride溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高压灭菌121 °C, 15 lb, 20分钟处理。 基础篇-培养基 液体培养基贮存于4°C冰箱,避免光照，实验进行前放在37°C水杷中温热。 液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生氏不佳，可以再添 加适量 glutamine? 粉末培养基配制(以1升为例)： 细胞培养基通常须添加10 %血清,因此粉末培养基之配制体积为900 ml, pH为7.2 - 7.4。 NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差,或局部过碱。因此 粉末培养垒及NaHCOs粉末M分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH,而非用强酸(HCI)或强碱(Na OH),因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。 材料：纯水（milli-Q水或二次至三次蒸懈水，水品质非常朿要），粉末培养基，NaHCCb ,电 磁搅拌器无菌血清瓶，0.1或0.2 mm无菌过滤膜，pH计，真空泵，CO?气体。 步骤： 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q水中，搅拌使其溶解。 称取适量之NaHCO3粉末溶于200ml milli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO?气体至饱 和，约3?5分钟。 将溶解t