第五章固定化酶.pptVIP

第五章 固定化酶及酶反应器 （Immobilized Enzyme and Reactors for enzymatic catalysis） ;Contents of chapter 5;问题：酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使用，而且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。 办法：将水溶性酶或游离细胞经过化学或物理手段处理，将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子在此区间进行活跃的催化作用，成为不溶于水的固定化的酶或细胞。 固定化酶:固定在载体上，并在一定范围内进行催化反应的酶。;第五章固定化酶; 1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。 1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。 1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。 1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。;二、 固定化酶的制备;Methods of immobilization;(一) 吸附法 吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。 只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。;根据吸附剂的特点又分为两种：;离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。 最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。 离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。; 1.影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素: pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。 载体：对于非多孔性载体，则???粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。;优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。 世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAE-Sephadex A-25吸附的氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析。;（二） 包埋法;1、凝胶包埋法（胶格包埋法）： 将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 ： 先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。  它的机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。 ; 海藻酸钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 ，操作简单经济。 K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。 胶原和明胶也是常用的包埋载体。;2、微囊化包埋法;第五章固定化酶;优点：在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。 缺点：是只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。; （三） 共价结合（偶联）法 是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上（借助共价键将酶的非活性必需侧链基团和载体的功能基团进行偶连）。;第五章固定化酶; 1.共价偶联法中的影响因素（ 1 ）载体的物化性质：要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。（ 2 ）偶联反应的反应条件：必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。（ 3 ）偶联反应的选择：要尽量考虑到酶的其它功能基团所发生的副反应尽可能少。（ 4